论文部分内容阅读
背景与目的:牙周炎是以菌斑微生物为始动因子的多因素慢性炎症性疾病,同时与糖尿病存在密切相关性。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）作为牙龈卟啉单胞菌的重要毒力因子,可以与参与固有免疫的细胞的TLR2、TLR4结合,激活NF-κB通路,引发炎症因子的释放。晚期糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）可以与晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）结合,最终活化 NF-κB通路。因此,对于牙周炎合并糖尿病患者,TLR2、TLR4、RAGE均可作为潜在的治疗靶点。一氧化碳释放分子 3（carbon monoxide releasing molecule-3,CORM-3）在水溶液中能够持续释放一氧化碳（carbon monoxide,CO）,从而发挥CO的作用,比如改善缺血再灌注损伤、抗炎等。课题组前期发现,CORM-3可下调LPS诱导的人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）的TLR2、TLR4的表达,并减少其炎性因子的释放。本课题以人牙周膜细胞为体外实验模型,以LPS和高糖的共同刺激模拟糖尿病患者牙周炎的细胞环境,研究CORM-3对LPS和高糖诱导的人牙周膜细胞炎性因子表达的影响,并探讨其可能的作用机制。以糖尿病大鼠实验性牙周炎为体内实验模型,研究CORM-3对其牙周组织炎症反应的影响,以期为糖尿病合并牙周炎的临床治疗提供新的思路及实验依据。实验方法:第一部分CORM-3对LPS和高糖刺激的人牙周膜细胞炎性因子表达的影响采用组织块法分离培养hPDLCs,并用CCK-8法检测CORM-3对细胞活性的影响。取第3-6代hPDLCs,随机分组,空白对照组:不加刺激;LPS组:加入10 μg/mL LPS刺激 24 h;LPS+HG 组:高糖培养液,加入 10 μg/mL LPS 刺激 24 h;LPS+HG+CORM组:高糖培养液,加入10μg/mL LPS和400 μmol/L CORM-3溶液培养24 h。ELISA法检测炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8的表达。第二部分CORM-3对LPS和高糖刺激的人牙周膜细胞炎性因子表达影响的机制检测CORM-3对LPS和高糖刺激的人牙周膜细胞TLR2/TLR4/NF-κB通路相关分子及RAGE表达的影响。实验分组与上一部分相同。RT-qPCR和Western blot分别检测RAGE、TLR-2、TLR-4、MyD88、p65、p50、IκBα 的 mRNA 和蛋白表达水平,以及磷酸化蛋白P-p65、P-p50、P-IκBα的表达水平。为进一步明确RAGE在CORM-3调控作用中的地位,分别检测了 RAGE表达沉默和过表达对CORM-3调控作用的影响。取第3-6代hPDLCs,随机分为五组,空白对照组:高糖培养液,加LPS刺激24 h,不进行转染;NC组:高糖培养液,siRNA NC转染后加LPS刺激24h;NC+CORM组:高糖培养液,siRNANC转染后,24h后加LPS和CORM-3处理24 h;沉默组:高糖培养液,RAGE siRNA转染后加LPS刺激24 h;沉默+CORM组:高糖培养液,RAGE siRNA转染,24 h后加LPS和CORM-3处理24 h。RT-qPCR和Western blot分别检测以上各组细胞相关分子的表达水平,免疫荧光法观察NF-κB p65入核情况。然后进行RAGE过表达转染实验,随机分组,空白对照组:高糖培养液,加LPS刺激24 h,不进行转染;空载组:高糖培养液,空载体转染后加LPS刺激24h;空载+CORM组:高糖培养液,空载体转染,24h后加LPS和CORM-3处理24 h;过表达组:高糖培养液,RAGE过表达载体转染后加LPS刺激24 h;过表达+CORM组:高糖培养液,RAGE过表达载体转染,24 h后加LPS和CORM-3处理24 h。检测情况同沉默实验。第三部分CORM-3对糖尿病大鼠实验性牙周炎牙周组织炎症反应的影响20只雄性Wistar大鼠随机分为4组,每组5只,健康组:作为空白对照,腹腔注射生理盐水;CP组:实验性牙周炎大鼠模型,腹腔注射生理盐水;DM+CP组:糖尿病大鼠实验性牙周炎模型,腹腔注射生理盐水;CORM+DM+CP组:糖尿病大鼠实验性牙周炎模型,腹腔注射CORM溶液。大鼠实验性糖尿病的诱导是通过腹腔注射30 mg/kg STZ溶液,隔日一次,共注射3次。最后一次注射3d后取尾静脉血进行血糖测定,血糖≥16.65 mmol/L者判定为实验性糖尿病大鼠。若血糖浓度未达标,则追加注射。实验性牙周炎的诱导是结扎大鼠右上颌第二磨牙,并在其颊舌侧龈沟内各注射20 μL P.g菌液。建立于糖尿病大鼠的牙周炎模型,即为糖尿病大鼠实验性牙周炎模型。建模后两周进行取材,进行HE染色和Masson染色来观察牙周组织炎症状况。采用免疫组化法和免疫荧光法分别检测牙周组织中RAGE、NF-κB p65的表达情况。实验结果:第一部分CORM-3对LPS和高糖刺激的人牙周膜细胞炎性因子表达的影响在安全浓度范围内,CORM-3抑制炎性因子表达最明显的浓度为400 μmol/L,800μmol/LCORM-3对细胞存在毒性作用。ELISA结果显示,hPDLCs在LPS诱导下,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8的表达较对照组显著升高;同时增加高糖刺激后,其表达较LPS组进一步增加;而在400μmol/LCORM-3处理后,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8的表达显著下降。第二部分CORM-3对LPS和高糖刺激的人牙周膜细胞炎性因子表达影响的机制RT-qPCR 和 Western blot 结果显示 hPDLCs 在 LPS 作用下,TLR2、TLR4、RAGE和 NF-κB 通路相关分子 MyD88、IκBα、p65、p50、P-IκBα、P-p65、P-p50 的表达显著升高;同时增加高糖刺激后,其表达较LPS组进一步显著增加;而400μmol/LCORM-3显著降低通路相关分子的表达。RAGE表达沉默和过表达转染后,上述分子的表达水平也分别呈现显著降低和升高,400 μmol/L CORM-3显著降低转染后上述分子的表达。第三部分CORM-3对糖尿病大鼠实验性牙周炎牙周组织炎症反应的影响健康组大鼠牙周组织的RAGE及NF-κB p65的表达量较少,CP组和DM+CP组的牙周组织中RAGE及NF-κB p65的表达量明显增高,CORM-3降低了糖尿病大鼠实验性牙周炎牙周组织中RAGE及NF-κB p65的表达。结论:（1）CORM-3显著降低LPS和高糖刺激的hPDLCs炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8的表达与释放。（2）CORM-3显著抑制LPS和高糖刺激的hPDLCs TLR2、TLR4和RAGE的表达,并抑制NF-κB通路的激活。（3）CORM-3抑制糖尿病大鼠实验性牙周炎牙周组织的炎症反应,降低牙周组织中的RAGE、NF-κB p65的表达。