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目的外泌体microRNA参与阿兹海默症的发生和发展,长期慢性铅暴露同样可引起阿兹海默症样神经损伤症状,最终引起学习记忆能力下降。但是有关外泌体microRNA在铅神经毒性中的作用未见报道。本研究首先利用高通量测序方法检测铅作业工人血清外泌体microRNA表达谱的变化,并筛选关键差异microRNA。应用铅暴露大鼠模型及体外小胶质细胞染毒模型,初步阐明关键外泌体microRNA对其靶基因参与的信号通路的影响,探讨关键外泌体microRNA在铅致神经炎症损伤的作用及机制。本研究结果将丰富铅致神经炎症的机制,为铅作业人群的保护策略和监护措施提供新的靶点。方法1选取某蓄电池生产厂铅作业工人42和本厂非铅人员32人作为研究对象,提取血清外泌体,选择8名铅作业工人和4名对照工人的血清外泌体样本用于microRNA测序。2利用高通量测序方法进行外泌体转录组测序和生物信息学分析,筛选关键差异microRNAs（miR-124、miR-506）。应用Realtime-PCR法进行外泌体中差异microRNA表达的验证;3应用相关分析进行血清外泌体miR-124、miR-506表达与神经炎症和神经行为变化的相关性,应用分层回归分析进行中介效应分析。4 4-6周龄SPF级雄性SD大鼠60只,按照随机分组方式分为三组,分别为对照组、低铅暴露组和高铅暴露组,低铅暴露组和高铅暴露组大鼠分别饮用含有250 mg/L和500 mg/L的乙酸铅溶液,同时对照组大鼠饮用含有500mg/L的乙酸钠溶液;染毒时间共24周。5应用旷场试验、新物体识别实验及Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆和探究功能;ICP-MS检测大鼠全血铅水平;Realtime-PCR技术测定实验大鼠血清及脑脊液外泌体中miR-124、miR-506表达水平;6 Realtime-PCR及Westernblot技术检测大鼠皮质和小胶质细胞系BV-2中SOCS3、JAK/STAT通路关键蛋白（JAK2、p JAK2、STAT3及p STAT3）的mRNA及蛋白表达水平;利用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测细胞上清TNF-α及IL-1β水平;7应用脂质体（lipofectamine2000）转染技术,将miR-124 mimics及mimics negative control（NC）转染BV-2细胞进行miR-124敲降后效果分析。结果1人群血清外泌体表征结果显示:血清外泌体呈椭圆形,具有脂分子双层结构,外泌体平均为159.5nm,可见外泌体标志蛋白CD63的表达。2铅作业工人血清外泌体microRNA高通量测序分析结果发现:铅作业工人外泌体中差异表达的microRNAs共79个（P<0.05）,其中上调54个,下调25个;GO功能富集分析发现,差异基因的功能主要集中蛋白质结合、金属离子结合、核转录、转录调控等生物过程,KEGG功能富集分析发现靶基因主要富集的通路为MAPK信号通路,JAK/STAT信号通路,胰岛素信号通路和AMPK信号通路等。其中,miR-124及miR-506增加最为显著。中介效应结果显示外泌体miR-124和miR-506在铅暴露引起神经行为变化、情感状态变化、血清IL-1β中起到了部分中介效应,而二者在铅暴露引起血清TNF-α增加中起到完全中介效应。通过对差异表达显著的miR-124及miR-506与免疫炎症损伤相关通路（JAK/STAT、NF-κB、m TOR、TCR signaling pathway）分析表明,miR-124及miR-506的靶蛋白AKT3、GRB2、PK3R3、SOCS1、SOCS2、NRAS、SOCS3、TNF、PDPK1、RELA及PLCG1可多条免疫炎症信号通路,其中靶基因SOCS3参与JAK/STAT及NF-κB信号通路的调控。Realtime-PCR验证结果表明铅作业工人血清外泌体miR-124及miR-506表达高于对照工人,与外泌体microRNA测序的结果一致。3相关分析发现血清外泌体miR-124、miR-506表达与情感得分相关;且均与系列加减、视觉保留、记忆扫描、目标追踪得分均呈负相关。与神经行为综合指数NBI均呈负相关。此外,血清外泌体miR-124、miR-506表达还与血清炎症因子水平呈正相关。4铅暴露24周后,低铅暴露组和高铅暴露组大鼠血铅水平分别为0.17±0.04μg/m L和0.32±0.09μg/m L,明显高于对照组（0.08±0.02μg/m L）,且逃避潜伏期高于对照组。旷场实验中,铅暴露大鼠总路程、中央格停留时间,水平穿格次数及站立次数均低于对照组,且高铅暴露组显著低于低铅暴露,差异有统计学意义;大鼠新物体识别能力检测显示,铅暴露大鼠对新物体的接触次数和接触时间比率均显著低于对照组。5低铅暴露组和高铅暴露组大鼠血清外泌体中miR-124及miR-506表达水平均高于对照组（P<0.05）,但是脑脊液外泌体中只有miR-124表达高于对照组（P<0.05）,未见脑脊液外泌体中miR-506表达与对照组有显著差异（P>0.05）。6低铅暴露组和高铅暴露组大鼠皮质中SOCS3的mRNA和蛋白表达均低于对照组（P<0.05）;低铅暴露组和高铅暴露组p JAK2及p STAT3表达蛋白水平升高;与对照组比较,低铅暴露组及高铅暴露组大鼠皮质中TNF-α、IL-1β蛋白含量增加（P<0.05）。7铅暴露大鼠脑脊液外泌体接种BV-2细胞12h和24h后,SOCS3 mRNA和蛋白表达均降低;JAK2及STAT3磷酸化蛋白水平上升（P<0.05）;BV-2细胞上清液中炎症因子TNF-α及IL-1β明显增加。8转染miR-124mimics至BV-2细胞后可见BV-2内miR-124的表达上升,细胞中SOCS3 mRNA表达和蛋白表达均显著下降;而JAK2及STAT3磷酸化水平增加,差异有统计学意义;同时,BV-2细胞上清中TNF-α及IL-1β也明显升高（P<0.05）。结论铅暴露可导致血清外泌体microRNA表达谱改变,其中以miR-124和miR-506表达变化较显著。差异表达的外泌体miR-124和miR-506与神经行为损伤和炎症因子IL-1β、TNF-α水平相关,且在血铅水平和神经行为损伤和炎症水平增加起到中介作用。miR-124可通过靶向抑制SOCS3的表达激活JAK/STAT信号通路,释放IL-1β、TNF-α,从而参与了铅的神经炎症损伤的发生和发展,提示外泌体miR-124可成为铅神经毒性防治的新靶点。图 40 幅;表 50 个;参 299 篇。