目的在全球范围内,食管癌对人类的健康造成了极大的危害,它是第九大常见的癌症及第六大癌症相关死亡原因,主要的病理类型有两种:食管腺癌(EAC,esophageal adenocarcinoma)和食管鳞癌(ESCC,esophageal squamous cell carcinoma)。食管癌的发病具有一定的地域差异,发病的危险因素可能有饮食模式、环境因素及个体遗传倾向等。在发展中国家ESCC是主要的病理类型,在中国ESCC约占食管癌病例的90%,其特点有浸润性、复发性和转移性等。目前,尽管在诊断和治疗方面有所进步,但ESCC患者的生存率仍不令人满意,5年生存率较低,因此,对食管鳞癌发病机制的研究显的尤为重要。本课题组在前期国家自然基金资助下(项目批准号:U1304813),发现JAK-STAT信号通路的持续激活在炎症诱导的食管鳞癌发生过程中起着关键作用。因此,本课题组使用高磷酸化与低磷酸化STAT3的移植性食管磷癌模型组织进行RNA测序、生物信息学软件分析,筛选出STAT3磷酸化可能调控的KIRREL3 基因。KIRREL3(Kin of Irre-like 3),又称 NEPH2,是一种免疫球蛋白超家族粘附分子,与突触形成、突触传递和超微结构有关。该基因位于人染色体11q24.2上,具有三个转录本。最初KIRREL3被认为是肾小球狭缝隔膜的一个连接成分,后期研究发现KIRREL3在大脑中也有很强的表达。截止到目前,KIRREL3在肿瘤组织中的表达、调控的信号转导机制以及是否参与调节肿瘤细胞恶性生物学特性的发展,尚不清楚。那么KIRREL3的表达变化是否调控食管鳞癌的分化、侵袭以及发展?STAT3的表达以及磷酸化如何影响KIRREL3的表达?目前关于以上问题未有相关文献报道。为了阐明上述问题,本课题组通过体外和体内实验进行了初步的探讨。体外实验:在食管鳞癌组织芯片中检测KIRREL3的表达;在食管鳞癌细胞中检测KIRREL3、STAT3、p-STAT3 表达,在 KIRREL3、p-STAT3 高表达的细胞中通过加入Stattic抑制剂和姜黄素来抑制p-STAT3的活性,探讨两者的关系;在KIRREL3高表达的细胞中运用siRNA干扰实验和慢病毒感染实验敲低KIRREL3,研究下调KIRREL3对食管鳞癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期及凋亡的影响;在KIRREL3低表达的细胞中运用慢病毒感染实验过表达KIRREL3,研究过表达KIRREL3对食管鳞癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响。体内实验:通过裸鼠成瘤实验检测KIRREL3的表达对食管鳞癌生长的影响以及与p-STAT3的关系。本课题组将进一步阐明KIRREL3在食管鳞癌中的作用机制,为食管磷癌的早期诊断和治疗提供新的候选靶点,为食管磷癌的发病机制研究奠定理论基础。方法1.运用免疫组织化学方法检测KIRREL3在74例食管鳞癌组织及69例癌旁组织中的表达。2.在食管鳞癌细胞系和正常食管上皮细胞中利用Western blotting检测KIRREL3、STAT3 和 p-STAT3 表达情况。3.探讨下调KIRREL3对食管鳞癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期及凋亡的影响。(1)在Eca109和KYSE150细胞中运用siRNA干扰实验和慢病毒感染实验敲低KIRREL3的表达。(2)Western blotting检测siRNA干扰和稳定敲低KIRREL3的效率。(3)CCK-8法检测下调KIRREL3对细胞增殖能力的影响,检测时间点分别为 0h、24 h、48h、72 h、96 h。(4)平板克隆实验检测下调KIRREL3对细胞克隆形成能力的影响。(5)Transwell实验检测下调KIRREL3对细胞侵袭和迁移的影响。(6)流式细胞术检测下调KIRREL3对细胞周期和凋亡的影响。4.探讨过表达KIRREL3对食管鳞癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。(1)在KIRREL3表达相对较低的KYSE30细胞中,用慢病毒感染实验构建KIRREL3过表达细胞株。(2)Western blotting 检测过表达 KIRREL3 的效率。(3)CCK8法检测过表达KIRREL3对细胞增殖的影响,检测时间点分别为0 h、24h、48h、72h、96h。(4)平板克隆实验检测过表达KIRREL3对细胞克隆形成能力的影响。(5)Transwell实验检测过表达KIRREL3对细胞侵袭和迁移的影响。5.探讨 KIRREL3 和 p-STAT3 的关系:在 KIRREL3 和 p-STAT3 高表达的 Eca109、KYSE150细胞中加入不同浓度的Stattic(0、5、10、20μM)和不同浓度的姜黄素(0、4、8、16 μM),运用Western blotting检测药物处理后KIRREL3和p-STAT3的表达情况。6.裸鼠成瘤实验检测KIRREL3的表达对食管鳞癌生长的影响以及KIRREL3和p-STAT3的关系。(1)选用 KYSE150-shControl、KYSE150-shKIRREL3、Eca109、Eca109-shControl和Eca109-shKIRREL3细胞构建裸鼠移植瘤模型,观察下调KIRREL3对食管鳞癌生长的影响。(2)在Eca109细胞构建的成瘤裸鼠体内腹腔注射siNC(0.5 mg/kg)、siKIRREL3(0.5 mg/kg),观察下调KIRREL3后对食管鳞癌生长的影响。(3)在Eca109细胞构建的成瘤裸鼠体内腹腔注射Stattic(5 mg/kg),观察对食管鳞癌生长的影响。结果1.组织芯片的结果表明,KIRREL3在食管鳞癌组织中的表达高于癌旁组织,并且它的表达与分化程度有关。2.Western blotting结果表明,KIRREL3在正常食管上皮细胞中的表达低于食管鳞癌细胞中的表达;KIRREL3在食管鳞癌细胞中的表达水平不一致,在KYSE150、Eca109、KYSE450、KYSE510 细胞中表达相对高,在 KYSE30细胞中表达相对低。STAT3、p-STAT3在食管鳞癌细胞中均有不同程度的高表达。3.食管鳞癌细胞中下调KIRREL3对细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期及凋亡的影响。(1)Western blotting鉴定敲低效率:在Eca109和KYSE150细胞中siRNA干扰实验和慢病毒感染的方法均成功敲低了 KIRREL3的表达。(2)CCK8检测细胞增殖结果:与对照组相比,下调KIRREL3后细胞的增殖能力受到抑制。(3)平板克隆实验结果:与对照组相比,下调KIRREL3后细胞的克隆形成能力受到抑制。(4)Transwell实验结果:与对照组相比,下调KIRREL3后细胞的侵袭、迁移能力受到抑制。(5)流式细胞术检测细胞周期及凋亡实验结果:与对照组相比,下调KIRREL3后细胞的周期受到阻滞,同时细胞凋亡数量增多。4.食管鳞癌细胞中上调KIRREL3对细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。(1)Western blotting鉴定过表达效率:与对照组相比,过表达组KIRREL3表达明显增加。(2)CCK8法检测细胞增殖结果:与对照组相比,过表达KIRREL3后细胞的增殖能力增强。(3)平板克隆实验结果:与对照组相比,过表达KIRREL3后细胞的克隆形成能力增强。(4)Transwell检测结果:与对照组相比,过表达KIRREL3后细胞的侵袭、迁移能力增强。5.KIRREL3和p-STAT3之间的关系。(1)Stattic 作用于 Eca109、KYSE150 细胞后,p-STAT3 表达随着 Stattic 浓度的增加逐渐下降,KIRREL3表达变化不明显,而是在Stattic作用的最大浓度受到抑制。(2)姜黄素作用于Eca109、KYSE150细胞后,p-STAT3、KIRREL3的表达随着姜黄素浓度的增加逐渐下降。6.裸鼠成瘤实验检测KIRREL3的表达对食管鳞癌生长的影响以及KIRREL3和p-STAT3的关系。(1)KYSE150-shControl 组、KYSE150-shKIRREL3 组和 Eca109-shControl 组、Eca109-shKIRREL3组的肿瘤生长结果:shKIRREL3敲低组与各自的shControl对照组相比,shKIRREL3敲低组肿瘤的体积和重量明显小于shControl 对照组。(2)siKIRREL3组与siNC对照组相比,siKIRREL3组肿瘤的体积和重量明显小于siNC对照组。(3)Stattic组与Eca109-shControl和siNC组相比,Stattic组肿瘤的体积和重量明显小于对照组。结论1.KIRREL3在食管鳞癌组织及大多数食管鳞癌细胞中都有较高的表达,同时在食管鳞癌组织中的表达与分化程度有关。2.KIRREL3的表达促进食管鳞癌细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,并且对细胞周期和凋亡也有一定的影响。