【摘 要】
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谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为一种重要的工业微生物,已被广泛用于发酵生产有机酸和氨基酸等物质。由于具有公认安全（Generally recognized as safe,GRAS）、生长速率快、所需的培养条件简单等特点,谷氨酸棒状杆菌具有巨大的研究价值。近年来,产重组蛋白谷氨酸棒杆菌微生物细胞工厂的创建成为研究热点。为了使谷氨酸棒杆菌更有效的生产重组蛋白
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谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为一种重要的工业微生物,已被广泛用于发酵生产有机酸和氨基酸等物质。由于具有公认安全（Generally recognized as safe,GRAS）、生长速率快、所需的培养条件简单等特点,谷氨酸棒状杆菌具有巨大的研究价值。近年来,产重组蛋白谷氨酸棒杆菌微生物细胞工厂的创建成为研究热点。为了使谷氨酸棒杆菌更有效的生产重组蛋白,需要开发具有优良性能的“基因表达工具盒”,其包括:宿主、载体、启动子、分泌途径等多种可调控基因表达的相关·元件。目前,几乎所有谷氨酸棒杆菌基因表达载体均以抗生素抗性基因作为筛选标记,这严重影响了工程菌株在工业化发酵生产上的应用。D-丙氨酸是微生物细胞壁不可或缺的重要组分,其是由丙氨酸消旋酶催化L-丙氨酸转化获得。因此,丙氨酸消旋酶基因可作为谷氨酸棒杆菌基因表达系统中表达载体的一种新型互补型筛选标记。本论文通过应用基因编辑技术,构建了以丙氨酸消旋酶基因为互补型筛选标记的谷氨酸棒状杆菌表达系统工程宿主菌,主要研究成果如下:（1）首先,分别利用λ-Red同源重组和CRISPR/Cas9介导基因编辑技术对大肠杆菌E.coli BL21菌株基因组上丙氨酸消旋酶编码基因alr进行敲除,并对这两种技术的敲除效率进行比较。然后,应用CRISPR/Cas9介导基因编辑技术进一步敲除基因组上的另一个丙氨酸消旋酶编码基因dadX,获得一株需要培养基中额外添加D-丙氨酸才能生长的大肠杆菌双基因敲除突变株E.coli BL21 Δalr ΔdadX。（2）构建携带alr基因的小质粒pAU27,转化E.coli BL21 Δalr ΔdadX双基因敲除突变株,在无额外添加D-.丙氨酸的培养基上获得正常生长的转化子,证明了小质粒上的alr基因可作为转化E.coli宿主菌的互补型筛选标记。（3）利用基于Cre/Loxp位点特异性重组基因敲除技术,对C.glutamicum ATCC13032菌株基因组上丙氨酸消旋酶的唯一编码基因alr进行敲除,获得一株需要外界额外供给D-丙氨酸才能生长的谷氨酸棒杆菌基因敲除突变株C.glutamicum ATCC13032 Δalr。（4）以pAU27为出发质粒,构建可在谷氨酸棒杆菌中稳定复制的E.coli-C.glutamicum基础穿梭质粒pAU28。pAU28转化基因敲除突变株C.glutamicum ATCC13032Δalr,在无额外添加D-丙氨酸的培养基上获得正常生长的转化子,证明穿梭质粒pAU28上的alr基因可作为转化C.glutamicum宿主菌的互补型筛选标记,C.glutamicum ATCC13032 Δalr可作为谷氨酸棒杆菌基因表达系统工程宿主菌株。
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