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目的:通过观察补肾生精方对少弱精大鼠模型睾丸、附睾组织质量、精液质量、血清性激素水平及转化生长因子-β超家族的细胞内信号内转导分子Smad1、Smad4基因在大鼠睾丸中表达的影响,探讨补肾生精方对腺嘌呤诱导的肾阳虚型少弱精大鼠模型作用机制,为临床治疗提供有效的科学依据。方法:将120只成熟的12周龄的SD雄性大鼠适用性饲养一周后,将其随机分为模型组、空白组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、西药对照组共6组,每组各20只。将腺嘌呤配成浓度为500mg/mL的混悬液,除空白组大鼠给予生理盐水灌胃外,其余各组均给予腺嘌呤进行灌胃,每日灌胃1次,共灌胃28天,造成肾阳虚型少弱精子症大鼠模型,每组取出2只大鼠,用免疫组化法检测睾丸及附睾组织造模是否成功。造模成功后,高、中、低剂量组分别给予不同剂量的补肾生精方灌胃治疗,灌胃剂量分别为高剂量组为5.52g/100g体重、中剂量组为2.76g/100g体重、低剂量组为1.38g/100g体重,而模型组和空白组每日均给予1mL/100g体重的生理盐水灌胃,西药对照组每日给予10ml/kg体重的左卡尼汀注射液灌胃,每组均连续灌胃28天。实验过程中观察大鼠一般状态(如毛色、活动、体态等),测日饮水量及进食量。实验结束后将大鼠全部处死,股动脉取血、分离血清、摘取睾丸、性腺及附属性腺称重,提取附睾精液。采用计算机辅助精子质量分析系统检测大鼠的精子密度、精子活动率、前向运动精子百分率;检测大鼠的体重、睾丸及附睾的质量;免疫组化法(SABC法)检测大鼠睾丸中Smad 1、Smad 4的水平;采用放免法检测各组大鼠的血清性腺激素睾酮(T)及黄体生成素(LH)水平、卵泡刺激素(FSH);采用实时荧光定量PCR法检测大鼠睾丸中Smad 1、Smad 4的定位和分布;Western Blot检测大鼠睾丸中Smad 1、Smad 4的水平及采用酶免法检测大鼠血清肝肾功能。结果:1.精子计数和精子活动力检测结果比较 空白组与模型组相比,差异显著具有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,高剂量组、中剂量组、低剂量组、西药对照组各药物治疗组精子计数和精子活动力显著提高,差异显著具有统计学意义(P<0.05),高剂量组精子计数和精子活动力明显高于中剂量组、低剂量组、西药对照组,差异显著具有统计学意义(P<0.05),而中剂量组与西药对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)2.补肾生精方对肾阳虚型大鼠性腺及附属性腺组织的影响 与空白组相比,其他各组大鼠体重均明显下降,差异显著具有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,高剂量组、中剂量组、西药对照组明显增高,差异显著具有统计学意义(P<0.05),低剂量组与模型组相比无明显差异(P>0.05),中剂量组与西药对照组相比无明显差异(P>0.05)。与空白组相比,各组大鼠睾丸湿重与附睾湿重均降低,差异显著具有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,高剂量组、中剂量组、西药对照组大鼠睾丸湿重与附睾湿重均升高,差异显著具有统计学意义(P<0.05),低剂量组与模型组相比无明显差异(P>0.05),中剂量组与西药对照组相比无明显差异(P>0.05)。3.免疫组化发检测各种Smad1、Smad4表达情况空白组及模型组中Smad1、Smad4在大鼠睾丸的各级生精细胞中均有表达,Smad1免疫反应阳性物质位于细胞质内,细胞核内为阴性,间质细胞及支持细胞均未见阳性表达;Smad4免疫反应阳性物质位于细胞核内,细胞质内为阴性,支持细胞、间质细胞及其他各级生精细胞均未见阳性表达。与模型组相比,其余各组Samd1的表达明显降低,差异显著,具有统计学意义(P<0.05),高剂量组Samd1的表达明显低于中剂量组、低剂量组、西药对照组,差异显著具有统计学意义(P<0.05),而中剂量组与西药对照组差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,其余各组Samd4的表达明显升高,差异显著,具有统计学意义(P<0.05),高剂量组Samd4的表达明显高于中剂量组、低剂量组、西药对照组,差异显著具有统计学意义(P<0.05),而中剂量组与西药对照组差异无统计学意义(P>0.05),4.各组动物血清中性激素水平检测比较分析 模型组中血清睾酮(T)水平降低,LH、FSH水平升高;而高、中、低剂量组血清睾酮(T)水平升高,LH、FSH水平降低,且高剂量组明显优于中、低剂量组,差异显著具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,其余各组血清睾酮(T)水平,LH、FSH水平均有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。5.各组大鼠睾丸中Smad1、Smad4mRNA半定量RT-PCR表达情况 在各组大鼠睾丸中,均可见到Smad1、Smad4的mRNA表达,其中在模型组中Smad1的mRNA表达被抑制,Smad4的mRNA表达上调,而自拟补肾生精方高剂量组中Smad 1的mRNA表达被上调,Smad4的mRNA的表法被抑制。6.酶免疫法检测肾脏功能情况 通过解剖观察各组大鼠肾脏组织外观、病理组织学检查及超微结构进行观察均无明显改变,且血清检查亦无明显改变,说明自拟补肾生精方治疗肾阳虚型少弱精不育大鼠安全可靠,无明显不良反应。结论:1.补肾生精方能够有效增加精液密度,有效提高精子的活率及活力,并通过调节睾酮的分泌,增加睾丸及附属性腺的质量,使生精环境得到改善。2.补肾生精方能够促进大鼠生长代谢以及大鼠睾丸及附睾组织的发育。3.补肾生精方治疗后能促进下丘脑-垂体分泌和调节促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)释放,提高睾酮(T)浓度,降低雌二醇(E2)含量,调节下丘脑-垂体-睾丸轴功能,改善性腺轴的功能紊乱。4.补肾生精方通过调控大鼠睾丸中TGF-β超家族的细胞内信号转导分子Smads基因的表达,其可明显增加Smad1在肾阳虚型少弱精大鼠睾丸中的表达,降低Smad4在肾阳虚型少弱精大鼠睾丸中的表达,且能够上调Smad1的mRNA表达,抑制Smad4的mRNA的表达,说明Smads在肾阳虚型少弱精大鼠模型中起到了重要的作用,直接或间接促进精子的生成。5.通过酶免疫法检测各组大鼠血清中肾功能均无显著变化,证明补肾生精方治疗肾阳虚型少弱精不育大鼠安全可靠,无明显不良反应。