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背景与目的胶质瘤干细胞是胶质瘤发生的始动细胞,是其复发、转移的根本原因。由胶质瘤干细胞分化而来的其它非成瘤肿瘤细胞只有有限的增殖潜能,不具有致瘤能力。以胶质瘤干细胞为治疗靶细胞更可能取得对人恶性胶质瘤治疗的成功。研究显示,肿瘤干细胞较肿瘤内其它非成瘤肿瘤细胞对放疗、化疗更为抗拒。胶质瘤干细胞与神经干细胞有着密切联系和诸多共同之处,缺乏特异性分子标志的表达,这也为分子靶向治疗带来很大困难。STAT3在胚胎发育中胚胎干细胞多能性的维持中起着重要作用。同时它又与多种肿瘤的发生、发展有着密切联系,被认为是一个癌基因。Stat3的持续活化可以使细胞发生恶性转化,诱导细胞抗凋亡因子等的表达,从而促进细胞的增殖和对抗凋亡。通过当前脑肿瘤干细胞体外培养的方法我们获得了一些启示。当前在人脑胶质瘤干细胞的体外培养中均采用加入LIF等的无血清神经干细胞培养液。LIF是JAK/STAT3信号途径的重要刺激因子。故我们推测STAT3基因在人胶质瘤干细胞的增殖和分化中可能发挥重要作用。为此,本研究拟在分离、纯化和鉴定人恶性胶质瘤干细胞后,构建并包装可表达STAT3基因特异性siRNA的慢病毒载体病毒,感染胶质瘤干细胞后阻断STAT3基因的表达,观察其对胶质瘤干细胞增殖、分化、凋亡的影响。方法1.分离并鉴定胶质瘤干细胞:采用神经干细胞培养方法分离、纯化人恶性胶质瘤干细胞;免疫细胞化学检测胶质瘤干细胞CD133、GFAP、MAP2和MBP的表达;有限梯度稀释实验、二代球体形成分析、流式细胞分析确定胶质瘤干细胞所占比例和其自我更新能力;分化实验确定其多能分化能力;增殖测定观察增殖能力;裸鼠移植瘤实验,观察胶质瘤干细胞成瘤能力。2.制备STAT3 siRNA载体病毒:构建STAT3 RNA干扰慢病毒载体;pSC-shSTAT3,pCMV-dR8.74,pMD2G共转染293T包装细胞,收集可表达STAT3特异性siRNA慢病毒载体的病毒颗粒pSC-LT;流式细胞分析测定载体病毒对胶质瘤干细胞的感染效率;pSC-LT感染胶质瘤干细胞后,Realtime Q-PCR和Westernblot检测细胞STAT3 mRNA和蛋白表达水平,了解pSC-LT对STAT3基因的干扰效率。3.观察胶质瘤干细胞感染pSC-LT后的增殖、分化:细胞增殖试剂盒测定细胞生长曲线;流式细胞分析细胞周期分布改变;流式细胞分析及免疫荧光观察CD133+胶质瘤干细胞比例;裸鼠移植瘤实验观察细胞成瘤能力变化。4.胶质瘤干细胞感染pSC-LT后细胞凋亡检测:流式细胞分析、荧光染色观察感染后细胞凋亡情况;Realtime Q-PCR和Westernblot检测细胞感染前后凋亡相关基因表达。结果3例患者原代培养胶质瘤细胞中CD133+细胞分别为7.4%,2.8%,4.2%。每100个原代胶质瘤细胞中可形成1个左右的胶质瘤干细胞球;胶质瘤干细胞球细胞均表达神经干细胞标记CD133,不表达分化标志GFAP、MAP2,少数细胞表达分化标记MBP。每100个原代胶质瘤干细胞球细胞可形成6.07±2.15个悬浮生长的二代胶质瘤细胞球,二代干细胞球细胞表达CD133。胶质瘤干细胞球细胞分化后细胞多数表达GFAP、少数表达MAP2、MBP。胶质瘤球体干细胞的增殖较原代胶质瘤细胞慢。胶质瘤干细胞1×103个时可成瘤,原代培养的胶质瘤细胞需1×107个。载体病毒pSC-LT、pSC-LC对恶性胶质瘤干细胞的感染效率均为98.6%。pSC-LT载体病毒感染组胶质瘤干细胞STAT3 mRNA水平较未感染组和阴性对照pSC-LC病毒感染组胶质瘤干细胞显著下降(P<0.01),抑制率为84.3%。Westernblot检测显示pSC-LT感染组胶质瘤干细胞较未感染组细胞Stat3蛋白下降81.5%,pStat3下降97.9%。与阴性对照病毒感染细胞比较,pSC-LT感染组胶质瘤干细胞在神经干细胞培养液中由悬浮球状生长变为贴壁生长,增殖变慢,细胞周期分析显示G1期比例显著增高(P<0.05),CD133+细胞由92.2%下降至5.7%(P<0.01)。pSC-LT感染组胶质瘤干细胞在1×104个细胞/只接种裸鼠后均未成瘤,致瘤能力较阴性对照病毒pSC-LC感染组和未感染胶质瘤干细胞显著下降。流式细胞分析显示pSC-LT感染组细胞的凋亡率为16%,较pSC-LC感染组(3.2%)、未感染组(2%)显著增高(P<0.05)。Realtime Q-PCR和Weaternblot检测显示pSC-LT感染组细胞较pSC-LC感染组和未感染组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下降,BAX、Caspase-3基因表达无明显变化(P>0.05)。结论1.我们采用神经干细胞培养方法成功分离了人恶性脑胶质瘤干细胞,并对其多能性和自我更新能力等进行了鉴定。2.利用慢病毒siRNA表达载体pSC-GFP构建、包装的STAT3基因特异性siRNA表达载体病毒pSC-LT对人胶质瘤干细胞具有很高的感染效率,感染胶质瘤干细胞后可显著的抑制细胞STAT3蛋白表达和活化。3.胶质瘤干细胞在STAT3基因表达和活化被阻断后细胞出现增殖受抑、G1期阻滞,CD133细胞比例下降、细胞进入分化,成瘤能力显著下降,说明STAT3基因在人胶质瘤干细胞的增殖和分化调节中起着重要作用。4.通过RNA干扰阻断胶质瘤干细胞STAT3基因表达后细胞凋亡增加,凋亡的增加可能与STAT3阻断后引起的下游凋亡相关基因Bcl-2表达下降有关。