细胞凋亡是细胞的程序性死亡,是由基因控制的细胞自主有序的死亡。凋亡是多基因严格控制的的过程,其中Bcl-2家族是细胞凋亡的重要调控分子。根据功能,Bcl-2家族蛋白可分为抗凋亡蛋白,促凋亡蛋白和BH3-only蛋白。这些分子相互作用,相互影响,共同组成了调控细胞凋亡的分子网络。因此,靶向Bcl-2家族抗凋亡蛋白,诱导肿瘤细胞发生凋亡,成为近年来肿瘤治疗和化疗药开发的新方向。而ABT737是人工合成的BH3小分子模拟物,能够靶向抗凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xl和Bcl-w,诱导细胞凋亡,为我们探讨恶性肿瘤细胞凋亡抵抗提供了一个工具。SIRT3是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD~+依赖的蛋白去乙酰化酶sirtuin家族的一员,主要定位在线粒体中,调控线粒体蛋白的乙酰化水平。SIRT3通过它的去乙酰化作用参与到多种细胞过程中,包括物质代谢,电子传递,氧化应激和细胞凋亡。SIRT3在肿瘤中具有双重作用,在某些肿瘤中表现为肿瘤抑制作用,而在另外一些情况中呈现出促进肿瘤细胞存活的作用。我们前期研究发现,在卵巢癌SKOV-3中,SIRT3参与到Bcl-2抑制剂S1诱导的细胞凋亡过程中,且起到促进细胞凋亡的作用,提示Sirt3与Bcl-2家族蛋白调控凋亡有关。本实验主要探究在卵巢癌SKOV-3细胞中,SIRT3在Bcl-2抗凋亡蛋白抑制剂ABT737诱导的细胞凋亡过程中的作用,及其作用机制。实验方法:(1)MTT法检测ABT737对NC组和过表达SIRT3组细胞活性的影响;实时无标记动态细胞分析(RTCA)技术检测ABT737对NC组细胞和过表达SIRT3组细胞生长速率的影响。(2)流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电势变化。(3)BH3分析技术检测细胞线粒体“凋亡启动”水平。(4)Western Blot检测Bcl-2家族蛋白及HKⅡ的线粒体表达水平。(5)免疫共沉淀技术检测CyclophilinD的乙酰化水平。实验结果:(1)过表达SIRT3组细胞对ABT737的细胞毒作用更敏感,细胞活力较NC组低,生长速率较NC组慢。(2)过表达SIRT3组细胞凋亡率与NC组相比没有显著变化;过表达SIRT3且加药处理组的细胞相对单加药组凋亡率明显增加。(3)过表达SIRT3组的线粒体膜电势与NC组相比没有显著降低;过表达SIRT3并加ABT737处理组线粒体膜电势下降程度较单加ABT737处理组显著增加。(4)与NC组相比,过表达SIRT3组细胞荧光变化率更低,对多种BH3短肽处理更敏感。(5)与NC组相比,过表达SIRT3组线粒体上Bcl-2促凋亡蛋白BAX、BAK、BIM和BID的表达水平显著增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达量无明显变化。(6)与NC组相比,过表达SIRT3组CyclophilinD乙酰化水平降低,HKⅡ在线粒体上的表达量减少。实验结论:(1)SIRT3能增加Bcl-2抗凋亡蛋白抑制剂ABT737对卵巢癌细胞的促凋亡作用。(2)高水平的SIRT3使卵巢癌SKOV-3细胞处于高水平的线粒体“凋亡启动”状态,故过表达SIRT3的SKOV-3细胞对ABT737更敏感。(3)SIRT3通过降低CyclophilinD的乙酰化水平介导HKⅡ从线粒体外膜上的解离,导致Bcl-2抗凋亡蛋白在线粒体上定位增加,细胞处于高水平线粒体“凋亡启动”状态。