猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumonia,APP）感染引起的一种主要的猪传染病。研究发现,由APP的Apx外毒素ApxⅡ和外膜蛋白OML1、OML7组成的新一代亚单位疫苗能够高效防治PCP。双顺反子设计（BCD）通过翻译偶联效应,可以有效地调节目的基因的表达,目前已广泛应用于原核表达系统。本课题利用双顺反子表达机制,从表达元件和表达条件入手,优化了大肠杆菌中PCP疫苗蛋白的表达。基于大肠杆菌强表达系统T7 RNAP表达系统的基础上,在p ET28a（+）载体目的基因的上游分别插入16个62 bp的前顺反子,构建BCD表达载体。以EGFP作为报告基因,通过比较荧光强度筛选出四个高表达的BCD载体p ET28a（+）-HT5、p ET28a（+）-HT8、p ET28a（+）-HT12Y、p ET28a（+）-HP11Y,相比p ET28a（+）分别提升了68%、65%、76%和80%。对BCD载体进行实时荧光定量PCR分析,发现其根据前顺反子序列的不同从转录和翻译两个方面提高目的基因的表达水平。用BCD表达载体和p ET28a（+）分别构建OML1、OML7和ApxⅡ截短蛋白ApxⅡ#5重组质粒。对于三个蛋白,BCD表达载体均表现出比p ET28a（+）更高的表达水平。在24孔板中对OML1、OML7、ApxⅡ的表达条件进行了优化。得到的最优表达条件为:温度为25℃,IPTG浓度为0.2 m M,加入IPTG前培养时间为2 h,在TB/SB培养基的基础上碳源为10 g·L-1的甘油,不外加氮源。此条件下OML1产量为1.15 g·L-1,OML7产量为1.20 g·L-1,ApxⅡ产量为0.73 g·L-1。在5 L发酵罐中分批补料生产OML1、OML7和ApxⅡ,OML1产量为2.43 g·L-1,OML7产量为2.59 g·L-1,ApxⅡ产量为1.21 g·L-1。对ApxⅡ分批补料发酵条件进行了优化,得到的最优发酵条件为:诱导温度为20℃,发酵液p H为7.0,DO为30%。此条件下ApxⅡ的产量达到1.50 g·L-1,为目前报道的最高水平。纯化后的ApxⅡ能特异性识别猪胸膜肺炎阳性血清。OML1、OML7和ApxⅡ可以保护小鼠免受猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7菌株（APP7）的攻击,攻毒7天后的存活率分别为90%、50%、80%,证明所表达的蛋白具有良好的免疫活性。本研究在大肠杆菌中建立了一套高效的双顺反子表达系统,并初步优化了大肠杆菌中PCP疫苗蛋白的表达,为进一步的工业化生产和应用提供了研究基础和方法参考。