论文部分内容阅读
目的:酒精性脂肪肝的诱发是肝脏对酒精滥用最为直接的反应,由酒精相关的毒性代谢反应与免疫反应之间复杂的相互作用所诱导,目前尚无针对酒精性脂肪肝公认有效的治疗药物。本实验旨在探究迷迭香活性成分鼠尾草酸,体内通过慢性酒精喂养加急性酒精灌胃诱导与体外酒精刺激AML12细胞以及LPS联合ATP刺激小鼠腹腔巨噬细胞建立酒精性脂肪肝模型,探究鼠尾草酸基于NLRP3炎症小体调控酒精性脂肪肝中脂肪蓄积与炎症的机制,为酒精性脂肪肝的临床候选药物提供新的选择。方法:1.慢性酒精喂养加急性酒精灌胃小鼠模型(NIAAA modle)的体内实验:选用C57BL/6雄性小鼠,将小鼠随机分为正常组(Pair-fed),慢性酒精喂养加急性酒精灌胃组(ETOH-fed),鼠尾草酸低剂量给药组(ETOH-fed+Car10 mg/kg),鼠尾草酸高剂量给药组(ETOH-fed+Car20 mg/kg),鼠尾草酸单独给药组(Car20mg/kg),阳性对照水飞蓟宾组(ETOH-fed+Silibinin100 mg/kg)。正常组与单独给药组给予Lieber-De Carli对照液体饲料15天,慢性酒精喂养加急性酒精灌胃组、鼠尾草酸给药组与阳性对照组小鼠给予对照液体饲料5天后开始给予5%的酒精液体饲料喂养小鼠十天,然后给予5 g/kg的酒精进行末次酒精灌胃。通过酶联免疫吸附实验以及选取相应的试剂盒检测小鼠血清IL-1β、AST、ALT以及TG含量;通过H&E、油红O染色与免疫组织化学染色观察肝脏组织病理学变化;通过Western blot分析小鼠肝脏中SREBP-1与炎症因子(P2X7R、NLRP3、ASC、IL-1β以及Caspase-1)的表达水平;通过RT-PCR实验进一步分析SREBP-1基因的表达水平;通过免疫荧光染色进一步分析细胞凋亡水平以及NE、MPO、F4/80与P2X7R的表达情况。2.酒精刺激AML12细胞的体外实验:分别给予AML12细胞不同浓度的鼠尾草酸(8、1.6、0.32μM),间隔1 h后使用酒精刺激24 h。收集细胞通过油红O染色实验观察细胞的形态学变化;提取总蛋白通过Western blotting分析AML12细胞中SREBP-1与炎症因子(P2X7R、NLRP3、ASC、IL-1β以及Caspase-1)的表达水平;通过免疫荧光实验进一步分析P2X7R以及Caspase-1的表达水平。3.LPS联合ATP刺激小鼠腹腔巨噬细胞的体外实验:给予小鼠腹腔巨噬细胞0-100μM的鼠尾草酸孵育24小时,MTT检测鼠尾草酸对小鼠腹腔巨噬细胞存活率影响。分别给予不同浓度的鼠尾草酸(8、1.6、0.32μM)孵育小鼠腹腔巨噬细胞,间隔1 h后,使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)预处理小鼠腹膜巨噬细胞4 h,然后给予三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞30 min。收集细胞与上清液分别提取细胞总蛋白,通过Western blot分析小鼠腹腔巨噬细胞中以及上清液中IL-1β、HMGB1以及Caspase-1的表达水平。通过酶联免疫吸附实验检测上清液中IL-1β含量。结果:1.体内实验:鼠尾草酸能够使小鼠血清IL-1β、AST、ALT以及TG含量显著降低,HE与油红O染色结果表明鼠尾草酸能够明显减轻酒精诱导的肝损伤与脂肪蓄积。鼠尾草酸使小鼠肝脏中SREBP-1与FASN表达水平下降,改善了酒精诱发的脂质蓄积。鼠尾草酸通过抑制P2X7R、NLRP3、Caspase-1、ASC以及IL-1β的表达抑制NLRP3炎症小体的激活,改善酒精诱发的炎症反应。鼠尾草酸通过抑制NE、F4/80以及MPO的表达,减轻细胞凋亡、巨噬细胞的激活以及中性粒细胞的募集。2.体外实验:鼠尾草酸在0-100μM浓度范围内无明显细胞毒性,鼠尾草酸显著下调了小鼠腹腔巨噬细胞上清液中IL-1β的含量。鼠尾草酸可抑制小鼠腹腔巨噬细胞内与其上清液中以及AML12细胞内SREBP-1 P2X7R、NLRP3、Caspase-1、ASC以及IL-1β的表达,改善LPS联合ATP刺激以及酒精刺激诱发的脂质蓄积与炎症反应。结论:鼠尾草酸对SREBP-1的表达以及P2X7R-Caspase-1-NLRP3炎症小体的激活具有抑制作用,从而改善酒精性脂肪肝中的脂肪蓄积与炎症反应。鼠尾草酸对巨噬细胞标志物F4/80与中性粒细胞标志物NE的表达以及酒精诱导的细胞凋亡具有一定的抑制作用,从而改善酒精性脂肪肝中由肝损伤诱导的炎性细胞浸润以及细胞凋亡。鼠尾草酸有望成为治疗酒精性脂肪肝的候选药物。