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胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cells)分离自囊胚的内细胞团,能在体外不断地自我更新,同时又保持着分化成不同类型细胞的能力,已经成为一种重要的发育分化模型,在再生医学里具有巨大的应用前景。自从1981年[1,2]成功分离小鼠ES细胞以来,维持多能性的培养条件已经得到了长足的优化。如细胞因子LIF可以替代饲养层细胞[3,4],或者用两个小分子CHIR99021(CHIR)和 PD0325901(PD03),即2i,抑制GSK3和MEK激酶后,屏蔽ES细胞的外部诱导分化信号,都能够在体外长期地维持小鼠ES细胞的自我更新[5]。特别是2i条件培养的小鼠ES细胞表达高度均一的多能性标志基因,如Oct4和Nanog[5,6]。2i已成功应用于分离难以获取ES细胞的小鼠品系和大鼠[7,8]。值得注意的是,2i/LIF应该是最好的ES细胞的培养条件,但任意组合两者都能促进小鼠ES细胞的自我更新[9,10],说明三者之间能够激活共同的或者具有互补作用的下游基因。但是三者之间有何联系,以及通过什么共同机制参与到维持ES细胞多能性至今还不清楚。LIF,CHIR和PD03通过分别激活LIF/STAT3信号通路,激活经典的Wnt/β-catenin信号通路,及抑制FGF/MEK/ERK信号通路来促进小鼠ES细胞的自我更新。但在无饲养层细胞的条件下,LIF是无法用于培养和分离非129品系的小鼠ES细胞,如C57BL/6,CBA及FVB品系,2i是必需的[10]。于是检测C57BL/6小鼠ES细胞分别培养在LIF和LIF+2i条件下全基因表达水平的变化,我们发现2i可以明显地提高Tfcp21l的表达水平,LIF+Tfcp211也可以维持C57BL/6小鼠ES细胞的自我更新。进而我们使用129来源的46C ES细胞,发现CHIR,PDO3和2i都能诱导Tfcp211的表达。接着我们构建了一个Tfcp211的可诱导表达细胞株,分别培养在无血清培养基N2B27中,并添加不同的小分子化合物,结果显示：①N2B27+Tfcp211 95% ES细胞死亡和分化；②N2827+CHIR+Tfcp211 95% ES细胞保持术分化的状态；③N2827+PD03+Tfcp21170%ES细胞保持未分化的状态；④维持在N2B27+Tfcp211+CHIR或PD03条件下的ES细胞保持着向三个胚层分化的能力。因此过表达Tfcp211可以替代PD037部分代替CHIR促进ES细胞的自我更新。鉴于LIF能够代替2i中的任一小分子来促进小鼠ES细胞的自我更新,于是我们在46C ES细胞中检测发现：①撤掉LIF后导致Tfcp211的表达水半急剧下降。②LIF/STAT3信号通路抑制剂阻断LIF诱导Tfcp211的表达。于是把上述构建的Tfcp211可诱导表达细胞培养在无LIF的血清培养基中,结果显示：①血清培养基+Tfcp211细胞保持未分化状态。②碱性磷酸酶染色呈阳性。③Oct4免疫荧光染色呈阳性。此外,过表达Tfcp211的STAT3敲除的小鼠ES细胞能够长期自我更新。进而利用慢病毒介导的shRNA在ES细胞中干扰下调Tfcp211的表达,发现Tfcp211表达水平下降后大大削弱了LIF促自我更新的作用。以上说明T fpcl21也是LIF/STAT3信号通路促小鼠ES自我更新的一个非常重要的下游基因。许多能够维持多能性相关的转录因子都能重编程源于着床后的上胚层干细胞(Epiblast stem cells, EpiSCs)回到ES细胞状态,特别是STAT3及其相关的下游基因,如KIf2/4/5, Nanog 和口Gbx2[11-13].上述已说明Tfcp211在LIF/STAT3中的重要作用,而且Tfcp211的表达在46C ES细胞向EpiSCs转变过程中急剧下降。通过在46C EpiSCs和分离自CDl小鼠的EpiSCs中过表达Tfcp211,并培养在2i+LIF的培养条件中,发现Tfcp211 EpiSCs产生了很多ES细胞样的克隆,这些克隆具有很高的碱性磷酸酶活性,并高表达ES细胞的标志基因。说明Tfcp211可以重编程EpiSCs回到ES细胞的状态。通过下调和诱导Tfcp211表达,我们发现Klf4和Nanog是Tfcp211的下游基因,但是下调Klf4的表达对Tfcp211促自我更新没有影响。过表达Tfcp211的Nanog敲除的ES细胞培养在不同的培养条件下发现：① N2B27+CHIR,95%细胞分化了；②无LlF的血清培养基,90%的细胞不能维持在末分化的状态。但是：①Nanog过表达可恢复Tfcp211下调所诱导的细胞分化；②Nanog表达下降会降低Tfcp211重编程EpiSCs回到ES细胞状态的效率。因此Nanog 是 Tfcp211促ES细胞自我更新的一个重要的下游分子。最后我们首次鉴定出Tfcp211蛋白N端的Q214和K216位的氨基酸,对其结合DNA和激活下游基因很重要,因为Q214&K216突变的Tfcp211①无法培养在N2B27+CHIR, N2B27+PD03及血清培养液中；②无法维持Nanog的表达水平；③无法增强由Nanog启动了驱动的荧光素酶活性。其次我们发现与Tfcp211具有高度同源性的CP2家族中的其他成员,在促进ES细胞自我更新方面不具有互补性,体现在它们无法支持ES细胞培养在N2B27+CHIR和无LIF的血清培养基中。总之,本研究证实了Tfcp211是LIF, CHIR和PD03的共同下游基因,并且在三者介导小鼠ES细胞的自我更新当中起着重要的作用,扩大了人们目前对ES细胞自我更新调控网络及“多能性基态(Pluripotent Ground State)”模型的理解。