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背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是原发于肝细胞的恶性肿瘤,是世界范围内最常见且恶性度最高的肿瘤之一。目前,仍以手术切除、放化疗等常规方法为主,但效果不理想且适应症窄。因而,肝癌的防治是我们面临的重大难题。深入探讨HCC的疾病分子机制,预防其发生并寻求药物治疗新靶点,延缓或逆转肝纤维化-HCC发展进程,是防治肝癌发生发展的重要手段。氧化应激反应（Oxidative stress,OS）是机体细胞衰老和癌变的重要诱因。活性氧（Reactive oxygen species,ROS）是机体发生氧化应激反应的代谢产物,参与调节细胞增殖和迁移等多种生理过程,ROS过量累积可引起脂质过氧化反应,破坏细胞内环境稳态,促使细胞表型发生改变,促使肿瘤发生。核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）信号轴介导的抗氧化作用是细胞抵御氧化应激损伤维持内环境稳态的重要方式。Smad3是TGF-β1/Smad信号转导通路的关键蛋白。研究证实,C-末端磷酸化的Smad3（pSmad3C）传递的细胞生长抑制信号向C-末端/连接区磷酸化的Smad2（pSmad2L/C）传递的促纤维化和连接区磷酸化的Smad3（pSmad3L）传递的促癌信号转化是肝癌进程发展的关键。黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ）是中药黄芪的主要活性成分,具有抗炎、抗纤维化、免疫调节和抗氧化等生物学活性。先前研究发现AS-Ⅳ可阻止上皮-间质转化抑制肝癌细胞侵袭,同时可激活Nrf2/HO-1通路减弱氧化应激和炎症反应,保护氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤;近期我们发现AS-Ⅳ可通过调控TGF-β1/Smad2/3与Nrf2/HO-1信号轴共同抑制DEN/CCl4/C2H5OH诱导的小鼠肝纤维化和大鼠肝星状细胞HSC-T6胶原合成,且AS-Ⅳ可调节pSmad3C/3L激活Nrf2/HO-1信号通路抑制TGF-β1刺激的肝癌Huh7细胞迁移和侵袭。鉴于,TGF-β1/Smad可能影响Nrf2/HO-1通路调控肝纤维化-肝癌进程,而Smad3是TGF-β1/Smad信号转导通路的关键蛋白。那么pSmad3C和pSmad3L分别选择性上调后Nrf2/HO-1信号轴改变如何影响HepG2细胞增殖、迁移和侵袭及AS-Ⅳ干预呢?进一步,Smad3 C-末端磷酸化位点突变后Nrf2/HO-1信号轴改变如何调控肝纤维化-肝癌进程及AS-Ⅳ干预呢?基于以上科学假说,本课题拟开展以下三个部分的研究:①在肝癌HepG2细胞中,观察TGF-β1诱导pSmad3C→pSmad3L激活Nrf2/HO-1信号轴调控HepG2细胞增殖、迁移和侵袭及AS-Ⅳ干预的机制;②在Smad3三种质粒转染的HepG2细胞中（分别编码Smad3基因L区/C-末端磷酸化位点突变）,观察选择性上调pSmad3C/3L表达后Nrf2/HO-1信号轴调控肝癌HepG2细胞增殖、迁移和侵袭及AS-Ⅳ的干预机制;③在Smad3基因C-末端磷酸化位点突变小鼠中,观察pSmad3C+/-后Nrf2/HO-1信号轴调控肝纤维化-肝癌进程及AS-Ⅳ的干预机制。第一部分 TGF-β1 诱导 pSmad3C→pSmad3L激活Nrf2/HO-1 信号轴调控HepG2细胞增殖、迁移和侵袭及AS-Ⅳ干预的机制研究目的:明确AS-Ⅳ抑制TGF-β1诱导的HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的机制不仅与pSmad3C→pSmad3L而且与促进Nrf2/HO-1信号轴活化有关。方法:①AS-Ⅳ对TGF-β1诱导肝癌HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的影响;取对数生长期HepG2细胞,经胰酶消化后制成单细胞悬液分别接种于相应孔板内,实验分为如下组别:溶媒对照组、40 pMTGF-β1刺激组、AS-Ⅳ（5 μM、10 μM、20μM）+TGF-β1刺激组。于相应组别加入AS-Ⅳ或/和TGF-β1,MTT检测不同浓度AS-Ⅳ对HepG2细胞增殖的影响;细胞划痕检测不同浓度AS-Ⅳ对HepG2细胞迁移的影响;Transwell检测不同浓度AS-Ⅳ对HepG2细胞侵袭的影响;②AS-Ⅳ对TGF-β1诱导肝癌HepG2细胞内氧化应激反应及Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达的影响:细胞处理和实验分组同第一部分方法①,其中TGF-β1浓度为9 pM（根据量效和时效关系确定的最佳浓度）。DCFH-DA探针法检测不同浓度AS-Ⅳ对HepG2细胞内ROS的影响;免疫荧光检测不同浓度AS-Ⅳ对HepG2细胞内Nrf2和pNrf2蛋白表达的影响;Western blot检测不同浓度AS-Ⅳ对HepG2细胞内pNrf2、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达的影响;③AS-Ⅳ对TGF-β1诱导肝癌HepG2细胞内TGF-β1/Smad3信号通路相关蛋白表达的影响:细胞处理和实验分组同第一部分方法②。免疫荧光检测不同浓度AS-Ⅳ对HepG2细胞内pSmad3C蛋白表达;Western blot检测不同浓度AS-Ⅳ对HepG2细胞内pSmad3C/3L、Smad3、α-SMA和PAI-1 蛋白表达的影响;结果:①MTT、划痕和Transwell结果显示,与对照组相比,40 pM TGF-β1刺激可明显促进HepG2细胞增殖、迁移和侵袭;5 μM、10μM和20 μM AS-Ⅳ处理呈浓度依赖性抑制TGF-β1诱导的HepG2细胞增殖、迁移和侵袭,差异具有统计学意义（P＜0.05）。②DCFH-DA探针显示,9 pM TGF-β1刺激可明显促进HepG2细胞内ROS水平,10μM和20 μM AS-Ⅳ作用可显著抑制TGF-β1诱导的HepG2细胞内ROS累积;细胞免疫荧光结果显示,10 μM和20 AS-Ⅳ可明显促进HepG2细胞内pNrf2蛋白表达,其中,20μM AS-Ⅳ可明显促进核内Nrf2蛋白表达;Western blot结果显示10μM与20 μM AS-Ⅳ可显著上调pNrf2与NQO1蛋白表达,而20 μM AS-Ⅳ可上调Nrf2与HO-1蛋白表达水平,差异具有统计学意义（P＜0.05）。③细胞免疫荧光结果显示,10 μM和20 μM AS-Ⅳ作用可明显促进胞内pSmad3C表达;Western blot结果显示,20 μM AS-Ⅳ作用可明显促进pSmad3C蛋白表达;10 μM与20 μMAS-Ⅳ作用可明显抑制pSmad3L和PAI-1蛋白表达水平,差异具有统计学意义（P＜0.05）;其中,Smad2和Smad3蛋白表达水平各组之间无明显变化;不同浓度AS-Ⅳ可降低α-SMA蛋白表达,差异无统计学意义（P＞0.05）。小结:TGF-β1不仅促进pSmad3C→pSmad3L增强HepG2细胞增殖、迁移和侵袭,而且伴随一定程度Nrf2/HO-1信号轴抑制,AS-Ⅳ作用可抑制pSmad3C→pSmad3L并促进Nrf2/HO-1信号轴活化,进而抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭。第二部分选择性上调pSmad3C/3L表达后Nrf2/HO-1信号轴调控HepG2细胞增殖、迁移和侵袭及AS-Ⅳ干预的机制研究目的:明确选择性上调pSmad3C/3L表达后AS-Ⅳ经由Nrf2/HO-1信号轴抑制肝癌HepG2细胞增殖、迁移和侵袭;方法:①Western blot验证Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A三种质粒稳转HepG2细胞内pSmad3C/3L蛋白表达;②选择性上调pSmad3C/3L对AS-Ⅳ调控HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的影响;取对数生长期Smad3三种质粒稳转HepG2细胞,经胰酶消化后制成单细胞悬液接种于相应孔板内,实验分组为Smad3 WT-HepG2组、Smad3 3S-A-HepG2组、Smad3 EPSM-HepG2组、Smad3 WT-HepG2+TGF-β1（40 pM）刺激组、Smad3 3S-A-HepG2+TGF-β1 刺激组、Smad3 EPSM-HepG2+TGF-β1 刺激组、Smad3 WT-HepG2+AS-Ⅳ（20 μM,根据前期量效关系确定最佳浓度）+TGF-β1刺激组、Smad3 EPSM-HepG2+AS-Ⅳ+TGF-β1刺激组、Smad3 3S-A-HepG2+AS-Ⅳ+TGF-β1刺激组。于相应组别加入AS-Ⅳ或/和TGF-β1,CCK-8检测AS-Ⅳ对三种质粒转染HepG2细胞增殖的影响;细胞划痕检测AS-Ⅳ对三种质粒转染HepG2细胞迁移的影响;Transwell检测AS-Ⅳ对三种质粒转染HepG2细胞侵袭的影响;③选择性上调pSmad3C/3L对AS-Ⅳ调控HepG2细胞内氧化应激反应和Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达的影响;细胞处理和实验分组同第二部分方法②,其中TGF-β1浓度为9 pM（根据量效和时效关系确定的最佳浓度）。DCFH-DA探针法检测AS-Ⅳ对三种质粒稳转HepG2细胞内ROS表达的影响;Western blot检测AS-Ⅳ对三种质粒转染HepG2细胞内Nrf2、pNrf2、HO-1和NQO1蛋白表达的影响;实时荧光定量PCR（qPCR）检测AS-Ⅳ对三种质粒转染HepG2细胞内HO-1 mRNA与NQO1 mRNA表达;结果:①Western blot结果显示,三种质粒转染组之间Smad3蛋白表达水平无明显变化;9 pM TGF-β1 刺激可促进 Smad3 WT-HepG2 细胞内 pSmad3C/pSmad3L 水平明显升高;同时,Smad3 EPSM-HepG2组pSmad3C水平明显升高,而Smad33S-A-HepG2组pSmad3L表达升高明显。差异具有统计学意义（P＜0.05）②CCK-8、划痕实验和Transwell实验结果显示,40 pM TGF-β1刺激可明显促进三种质粒转染HepG2细胞增殖、迁移和侵袭,其中以Smad3-3S-A-HepG2组最为明显,其效果为 Smad3-3S-A-HepG2＞Smad3-WT-HepG2＞Smad3-EPSM-HepG2细胞;20μMAS-Ⅳ可显著抑制TGF-β1诱导的三种质粒转染HepG2细胞增殖、迁移和侵袭,其抑制效率为 Smad3-EPSM-HepG2＞Smad3-WT-HepG2＞Smad3-3S-A-HepG2细胞,差异具有统计学意义（P＜0.05）。③DCFH-DA探针显示,20μM AS-Ⅳ干预处理可显著抑制TGF-β1诱导的三种质粒转染HepG2细胞内ROS累积,其抑制效率为Smad3-EPSM-HepG2＞Smad3-WT-HepG2＞Smad3-3S-A-HepG2细胞;实时荧光定量PCR结果显示,AS-Ⅳ干预可促进TGF-β1诱导的三种质粒转染HepG2细胞内HO-1 mRNA与NQO1 mRNA表达,其中以Smad3 EPSM-HepG2细胞内增加最为明显,其次为Smad3 WT-HepG2细胞组;Western blot结果显示,AS-Ⅳ干预可显著上调Smad3 WT-HepG2 与 Smad3 EPSM-HepG2 细胞内 pNrf2、Nrf2、HO-1 和 NQO1 蛋白表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。小结:选择性上调pSmad3C可激活Nrf2/HO-1信号轴增强AS-Ⅳ抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭;而选择性上调pSmad3L则作用相反。第三部分pSmad3C+/-后Nrf2/HO-1信号轴调控肝纤维化-肝癌进程及AS-Ⅳ干预的机制研究目的:明确Smad3基因C末端磷酸化位点突变后AS-Ⅳ抑制肝纤维化-肝癌进程经由Nrf2/HO-1信号轴的调控。方法:①PCR琼脂糖凝胶电泳实验检测小鼠基因型;②DEN/CCl4/C2H5OH诱导小鼠肝纤维化-肝癌模型,实验分组为WT-Control、WT-Model、WT-AS-Ⅳ、HT-Control、HT-Model、HT-AS-Ⅳ,每组20只。对照组给予无菌颗粒饲料和灭菌水自由饮。其他组小鼠给予100 mg/kg DEN于建模起始时腹腔注射,每周一次,共两周。第3周开始～第7周结束20%CCl4橄榄油溶液5ml/kg灌胃,每周两次,同时10%C2H5OH溶液自由饮,隔日更换。第8周开始～第18周结束20%CCl4橄榄油溶液6ml/kg灌胃,每周两次。于第19周始停止造模,给予常规饮食饮水至第20周末。AS-Ⅳ组于建模起始～第18周末予以0.5%CMC-Na溶液配制的40 mg/kg AS-Ⅳ灌胃给药,同时模型组给予同剂量0.5%CMC-Na溶液灌胃,每日一次。观察肝脏大体,评估肿瘤发生率,HE和Masson染色检测肝脏组织病理学改变;③pSmad3C+/-突变后AS-Ⅳ对DEN/CCl4/C2H5OH诱导肝纤维化-肝癌小鼠体内氧化应激及Nrf2/HO-1信号通路蛋白的影响;实验分组情况同第三部分方法②,试剂盒检测AS-Ⅳ对pSmad3C+/-突变小鼠肝组织中氧化应激指标MDA和SOD的影响,免疫荧光检测AS-Ⅳ对pSmad3C+/-突变小鼠肝脏组织中pNrf2蛋白表达及胞内分布的影响,Western blot检测AS-Ⅳ对pSmad3C+/-突变小鼠肝脏组织中Nrf2、pNrf2、HO-1和NQO1蛋白表达的影响;结果:①DEN/CCl4/C2H5OH造模12周后小鼠肝脏表面粗糙,边缘褶皱,其中以杂合子小鼠更为明显,表面伴点状颗粒形成。AS-Ⅳ治疗后肝脏表面渐光滑,边缘也较为锐利。HE和Masson染色显示,野生型模型组小鼠光镜下可见肝小叶结构破坏,炎细胞浸润,同时伴纤维组织增生。其中,杂合子组可见部分肝细胞坏死,脂肪变性,汇管区结构紊乱,肝小叶被弥漫性分布的胶原纤维包绕形成假小叶结构。AS-Ⅳ治疗后野生型组肝小叶结构改善,杂合子组仍可见少量炎细胞浸润和部分胶原纤维形成。20周模型组小鼠肝脏色泽暗淡、泛黄、质地较硬、边缘褶皱,伴颗粒状白色结节散在分布。其中,杂合子小鼠肝脏表面形成凸出肝叶的出血坏死性肿瘤灶。HE染色显示,模型组小鼠光镜下肝小叶结构混乱,肝细胞排列紊乱,大量空泡样坏死区形成,细胞核染色不一。杂合子小鼠上述现象更为显著,细胞核分裂象增多,伴弥漫性分布的肝癌细胞病灶区。AS-Ⅳ治疗后上述症状明显改善,且AS-Ⅳ对野生型小鼠抗肝癌效果明显强于杂合子小鼠。肝脏活检发现本次DEN/CCl4/C2H5OH造模后小鼠肝脏肿瘤发生率100%,AS-Ⅳ治疗后可明显降低肿瘤发生率,其中,以野生型小鼠肿瘤发生率降低明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）。②ELISA检测发现,DEN/CCl4/C2H5OH造模20周后,肝组织中MDA明显升高,而SOD值降低,相较于12周变化更为明显。40mg/Kg/d AS-Ⅳ治疗12周和20周后小鼠肝组织MDA值降低,而SOD值升高明显,其中野生型小鼠较杂合子小鼠变化更为明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）。③Western blot显示12周肝纤维化期和20周肝癌期,AS-Ⅳ给药治疗后pNrf2、HO-1和NQO1蛋白水平较DEN/CCl4/C2H5OH组明显升高。免疫荧光检测pNrf2蛋白表达进一步验证上述Western blot结果,其中20周野生型小鼠较杂合子小鼠pNrf2蛋白表达升高更为明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）。小结:pSmad3 C+/-突变可抑制Nrf2/HO-1通路激活减弱AS-Ⅳ在肝纤维化-肝癌小鼠中的抗肝癌形成作用。