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基于急性肺损伤（ALI）小鼠模型探究姜黄素的保护作用[背景/目的]急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是以进行性呼吸困难和顽固性低氧血症为临床特点的呼吸系统危重疾病,其发病机制复杂,治疗手段有限,临床预后不佳。近年来,研究者发现NLRP3炎性小体介导细胞焦亡的激活及其产生的炎性损伤在多种呼吸系统疾病的发病机制中起着重要的作用。因此,抑制NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡激活,阻断其介导的炎性损伤信号通路,可能是治疗ALI的关键途径。姜黄素（Curcumin）是姜科植物根茎中提取的天然黄色多酚类化合物,因其具有强大的抗炎、抗氧化、抗凋亡等药学特性而备受研究人员的关注。近年来,研究发现姜黄素可以有效抑制NLRP3炎症小体介导细胞焦亡的激活、阻止炎症介质的释放,在慢性阻塞性肺病、哮喘等多种炎性肺部疾病中起到减轻肺组织炎性损伤的作用。然而,姜黄素在脓毒症诱导ALI中的保护机制尚不明确。本研究采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）构建ALI小鼠模型,并使用姜黄素予以干预,拟探讨姜黄素对ALI的保护作用及其机制。[方法]将C57BL/6实验小鼠按随机数字表法进行分组,并给予相应的干预措施:①急性肺损伤模型组（CLP组）:通过盲肠结扎穿刺术构建脓毒症急性肺损伤模型;②假手术组（Sham组）:小鼠麻醉后于腹部中线进行切口,不做其他操作,进行假手术,随即关腹;③不同剂量姜黄素保护组（CLP+100/200-Cur组）:给与小鼠不同剂量（100 mg/kg/d或200 mg/kg/d）的姜黄素灌胃,末次灌胃后进行CLP术;④地塞米松保护组（CLP+5-DXM组）:小鼠CLP术后0、2以及12小时分别腹腔注射5 mg/kg地塞米松;⑤SIRT1抑制剂干预组（CLP+EX527组）:按照5 mg/kg/d的剂量给予小鼠腹腔注射SIRT1抑制剂EX527,CLP术前每两天腹腔注射1次,共给药3次,在末次注射结束后24小时行CLP术;⑥姜黄素保护后SIRT1抑制剂干预组（CLP+200-Cur+EX527组）:小鼠予以200 mg/kg/d剂量的姜黄素灌胃,连续5天;腹腔注射5 mg/kg/d的EX527,术前每两天腹腔注射1次,共给药3次,在末次干预结束后24小时行CLP术。计算各组小鼠生存率,同时观察各组小鼠肺组织病理变化的差异;检测各组小鼠肺组织湿干比（wetto dry ratio,W/D）、肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中蛋白含量、细胞分类及比例;检测小鼠肺组织中的髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活性;ELISA法检测各组小鼠血清中促炎细胞因子 CC 趋化因子 7（chemokine（C-C motif）ligand 7,CCL7）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白介素 6（interleukin 6,IL-6）表达水平;Western blot 检测小鼠肺组织 SIRT1、NF-κB、p-NF-κB 以及焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleave-caspase-1、GSDMD 和 GSDMD-N）的表达水平。[结果]与Sham组相比,CLP组小鼠肺组织病理学显示肺泡及间质正常结构严重破坏,肺泡间隔明显增宽,炎性细胞明显浸润肺泡腔内及周边,小鼠BALF中蛋白含量和肺组织湿干比增加,肺组织MPO活性增加,小鼠BALF中炎症细胞聚集及血清中促炎因子表达升高,肺组织中SIRT1蛋白降低,但NF-κB蛋白、焦亡相关蛋白明显增加,并伴有小鼠存活率下降。当给予不同剂量（100 mg/kg/d或200 mg/kg/d）姜黄素进行干预后,与CLP组相比,姜黄素干预组小鼠肺组织病理学损伤较CLP组小鼠明显减轻,死亡率显著下降。与此同时,姜黄素干预组小鼠BALF中蛋白含量和肺组织湿干比明显减少,肺组织MPO活性降低,BALF中炎症细胞聚集及血清中促炎因子表达明显下降,肺组织中SIRT1蛋白含量增加,并伴有NF-κB及焦亡相关蛋白的减少。但在予以SIRT1蛋白抑制剂EX527干预后,与CLP+200-Cur组小鼠相比,CLP+200-Cur+EX527组小鼠肺组织病理学损伤的程度明显加重,小鼠BALF中炎症细胞聚集及血清中促炎因子表达升高,肺组织中SIRT1蛋白降低,但NF-κB及焦亡相关蛋白明显增加。[结论]CLP介导的ALI小鼠的肺部炎症损伤明显。当给予不同剂量（100 mg/kg/d或200 mg/kg/d）姜黄素进行干预后,姜黄素对ALI小鼠肺组织细胞焦亡的表现出明显的抑制作用,从而对肺组织炎性损伤的产生保护效应。而在予以SIRT1蛋白抑制剂EX527干预后,姜黄素对ALI小鼠肺组织炎性损伤的保护作用明显减弱。姜黄素上调SIRT1蛋白表达抑制NLRP3炎性小体介导的肺脏巨噬细胞焦亡的作用机制[背景/目的]巨噬细胞是肺部重要的免疫细胞,具有启动、调节和终止炎症的强大作用,在肺部的免疫稳定中扮演重要的角色。研究发现,ALI发病机制中失控的炎症反应被认为与巨噬细胞的功能状态相关,其通过释放趋化/炎性细胞因子,调节其他免疫细胞、诱导炎性损伤,最终对ALI的发展和预后产生深远影响。随着研究的深入,学者们发现巨噬细胞焦亡及其介导的炎性损伤在ALI的发病机制中同样扮演着重要的角色。本研究的前期动物实验研究结果提示,姜黄素可以上调SIRT1蛋白表达水平、抑制NLRP3炎性小体介导细胞焦亡的激活从而减轻ALI小鼠的肺部炎性损伤。为此,本研究将进一步通过细胞实验研究阐明姜黄素上调SIRT1蛋白表达进而抑制NLRP3炎性小体介导巨噬细胞（RAW264.7）胞焦亡的作用机制。[方法]利用MTT法检测不同姜黄素浓度的干预对RAW264.7细胞活力影响,筛选出实验所用最佳姜黄素浓度（20、40、80 μM）,以及不同浓度LPS干预对RAW264.7细胞活力的影响,筛选实验最佳LPS干预浓度（1 μg/mL）。随后进行实验分组:①Control组:RAW264.7细胞正常培养,无任何干预;②LPS+ATP组:RAW264.7细胞予以LPS（1μg/mL）处理24小时,后再加入ATP（5 mM）处理30分钟;③20/40/80-Cur+（LPS+ATP）组:RAW264.7细胞予以20、40、80 μM姜黄素预处理2小时后,加入LPS（1 μg/mL）处理24小时。其后再加入ATP（5 mM）处理30分钟;④10-EX527+80Cur组:RAW264.7细胞予以80 μM姜黄素和10 μM EX527预处理2小时;⑤10-EX527+80Cur+（LPS+ATP）组:RAW264.7细胞予以80 μM姜黄素和EX527预处理2小时后,加入LPS（1μg/mL）处理24小时。其后再加入ATP（5 mM）处理30分钟。观察指标并进行统计:MTT检测各组细胞活力变化;Hoechst33342/PI双染法检测各组细胞的细胞焦亡率;ELISA检测各组细胞上清液中炎症因子（CCL7、TNF-α、IL-6）表达;免疫荧光法检测各组细胞中SIRT1和NLRP3蛋白的表达;Western blot检测各组细胞中SIRT1、NF-κB、p-NF-κB以及焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleave-caspase-1、IL-1β、Cleaved IL-1β、GSDMD和GSDMD-N）的表达。[结果]姜黄素对巨噬细胞焦亡具有明显的抑制作用,主要表现为:姜黄素抑制LPS+ATP介导巨噬细胞活性的下降、降低了 LPS+ATP刺激下的巨噬细胞焦亡率以及巨噬细胞产生炎性因子水平。与此同时,姜黄素上调巨噬细胞SIRT1蛋白表达水平,抑制NF-κB、NLRP3及细胞焦亡相关蛋白表达水平。当给予SIRT1抑制剂EX527后发现,EX527下调SIRT1蛋白表达水平,减弱姜黄素对LPS+ATP介导巨噬细胞上调SIRT1的作用以及NLRP3蛋白、焦亡相关蛋白的下调作用。因而,SIRT1蛋白抑制剂EX527减弱姜黄素对LPS+ATP介导巨噬细胞活性下降的保护作用、减弱姜黄素对巨噬细胞焦亡的抑制作用及促炎细胞因子表达水平的下调作用。[结论]姜黄素通过抑制LPS+ATP介导的巨噬细胞活性的下降,减轻巨噬细胞炎性损伤,对巨噬细胞焦亡产生明显的抑制作用。SIRT1蛋白抑制剂EX527下调SIRT1蛋白表达水平,减弱姜黄素对巨噬细胞焦亡的抑制作用和炎性损伤的保护效应。