【摘 要】
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病原微生物是指可以侵犯人体,引起感染甚至传染病的微生物,也称病原体。病原微生物传播速度快、范围广,严重威胁着人类的生命健康和生产生活,快速灵敏的病原体检测方法可以有效的控制疾病传播并防止疾病爆发等。传统病原微生物检验方法如平板培养、PCR等虽然在一定程度上可以起到临床诊断的效果,但仍然存在着灵敏度低、成本昂贵、便携性差等问题,这使它们在诊断低浓度样本、混合感染或不明原因感染时显示出局限性。20世纪
【机 构】
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中国科学院大学(中国科学院精密测量科学与技术创新研究院)
【出 处】
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中国科学院大学(中国科学院精密测量科学与技术创新研究院)
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病原微生物是指可以侵犯人体,引起感染甚至传染病的微生物,也称病原体。病原微生物传播速度快、范围广,严重威胁着人类的生命健康和生产生活,快速灵敏的病原体检测方法可以有效的控制疾病传播并防止疾病爆发等。传统病原微生物检验方法如平板培养、PCR等虽然在一定程度上可以起到临床诊断的效果,但仍然存在着灵敏度低、成本昂贵、便携性差等问题,这使它们在诊断低浓度样本、混合感染或不明原因感染时显示出局限性。20世纪以来,病毒变异的加快以及全球化进程的加速给传染病的防治带来新的挑战,对病原微生物诊断的准确性、时效性以及便携性提出了更高的要求,因此发展灵敏快速、特异性好、操作简单的新型病原微生物检测方法意义重大。本论文主要针对病原微生物的生物标志物检测开展相关研究:一方面以蛋白质和核酸这两类常用的生物标志物为研究对象,结合微流控、恒温信号放大、和CRISPR/Cas12a等技术开发新型的病原体（如人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus,HPV）、肠溶血性大肠杆菌（E.coli O157:H7））检测方法;另一方面基于高分辨质谱平台进行蛋白质组学分析,找出了致病菌（如黄曲霉菌（Aspergillus flavus,A.flavus））的潜在蛋白类标志物。这些方法为病原微生物的高效、快速检测提供了新的策略,具体研究成果如下:1.针对目前核酸检测方法灵敏度和特异性不足的问题,发展了基于CRISPR/Cas12a体系的新型核酸检测平台。已有研究表明Cas12a可以反式剪切ssDNA并被广泛用于核酸靶标的检测;而本研究首次发现并证实Cas 12a可以反式剪切 DNAG-quadruplex（G4）和 G-Triplex（G3）,基于此我们建立了 G-CRISPR检测平台。与利用ssDNA作为报告分子的平台相比,G-CRISPR在灵敏度上体现了明显的优势,对于未扩增和扩增的质粒检测灵敏度分别可达50 pM和0.1 aM,分别提高了 20倍和10倍。这些具有高级空间的G4和G3作为新的报告分子可以显著提高核酸检测的灵敏度,其主要原因是这些具有高级空间结构的G4或G3在被剪切前后可以带来更显著的荧光变化。G-CRISPR在临床27个HPV病人样本的检测中显示出高特异性和准确性,阳性预测和阴性预测分别达100%和97.5%。G-CRISPR这一核酸检测平台有望广泛应用于病原微生物的快速检测。2.针对目前病原菌蛋白标志物检测繁琐的问题,本论文发展了一种基于微流控芯片的E.coli O157:H7裸眼定量检测平台:EA-Sensor。本研究开创性地将核酸适配体、杂交链式反应和微流控芯片等技术结合起来用于病原微生物的检测,将肉眼不可见的E.coli O157:H7浓度信息转化成为肉眼可见的指示剂长度信息,从而实现裸眼定量检测。EA-Sensor的检测灵敏度可达250 CFU/mL,可准确检测出牛奶等复杂体系中E.coli的浓度。EA-Sensor具有特异性高、操作简单、结果裸眼可视和无需仪器等优势,有望作为一种即时检测工具用于资源受限的地区进行E.coli O157:H7或其他病原体的快速检测中。3.针对目前部分病原微生物缺少合适的蛋白类生物标志物的问题,本研究利用高分辨质谱等分析技术,通过定量蛋白质组学研究了 5种具有不同产毒能力的黄曲霉菌株。我们总共定量了 4,363种蛋白质,其中1,045种蛋白具有显著表达差异,这些蛋白主要通过碳代谢途径来调控产毒。根据蛋白表达水平差异以及蛋白质定位等信息成功筛选出了可用于快速鉴定黄曲霉菌株的潜在标记物,如RodA、RodB等,并进一步对引起产毒差异的分子机制进行了初步探讨。该工作所建立的定量蛋白质组学分析方法为研究黄曲霉菌株的蛋白类标志物提供了一种新方法,也可广泛应用于其他病原微生物的相关研究。综上所述,本研究开发了一系列新型的病原微生物的分析方法,并将之应用于HPV、E.coli O157:H7和A.flavus等常见致病微生物的检测和分析中。本文的研究成果有望为病原微生物快速、低成本检测方法的开发提供重要参考,同时为临床诊断工具的研发提供新思路。
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