TGF-β1基因修饰的小鼠间充质干细胞对异基因造血干细胞移植后aGVHD的保护作用及潜在机制的研究

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背景和目的:异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治愈血液系统恶性疾病的有效途径。急性移植物抗宿主病(aGVHD)是allo-HSCT后常见的并发症。间充质干细胞(MSC)作为一种成体干细胞具有免疫抑制功能,对激素难治性aGVHD有一定疗效,然而各临床结果不一致,其作用机制仍不明确。TGF-β1是一种具有免疫调节作用的细胞因子。在本研究中,我们在小鼠骨髓MSC中过表达TGF-β1,研究其对异体淋巴细胞增殖及功能的影响以对小鼠aGVHD的预防和治疗作用,为allo-HSCT后aGVHD的诊治提供新思路,探索新方法。研究方法:1.分离、培养C57小鼠骨髓来源MSC,并分别通过形态学,免疫表型,中胚层三系分化检测对其进行鉴定;2.构建过表达TGF-β1基因的慢病毒载体并感染MSC(MSC-TGF-β1),荧光显微镜观察感染后细胞,通过RT-PCR及Western blot的方法分别检测TGF-β1在mRNA和蛋白水平的表达情况,并通过流式技术检测MSC-TGF-β1的免疫表型;3.将MSC-TGF-β1与异体淋巴细胞体外共培养,应用CFSE细胞增殖试剂盒及流式方法检测异体淋巴细胞的增殖程度,应用ELISA试剂盒检测共培养体系中细胞因子分泌情况;4.建立小鼠异基因造血干细胞移植后aGVHD模型,观察预防性及治疗性输注MSC-TGF-β1后小鼠aGVHD疾病的相关表现,包括临床表现、生存期及病理变化;5.通过流式技术检测MSC-TGF-β1输注后对小鼠体内巨噬细胞,调节性T细胞等免疫细胞的影响,以研究MSC-TGF-β1发挥作用的潜在机制。结果:1.成功分离、培养小鼠骨髓间充质干细胞,细胞呈典型的长梭形,成纤维细胞样,流式检测细胞CD29,Sca-1表达阳性,CD11c表达阴性,且细胞成骨,成脂,成软骨三系分化实验成功;2.成功构建TGF-β1过表达慢病毒载体,并感染MSC。显微镜观察及流式检测显示MSC-TGF-β1的形态及免疫表型没有发生改变。RT-PCR实验显示与MSC、MSC-GFP-puro(MSC转染空载体慢病毒)相比,MSC-TGF-β1组细胞中TGF-β1 mRNA 高表达;Western blot 实验显示与 MSC、MSC-GFP-puro 相比,MSC-TGF-β1组细胞中TGF-β1蛋白高表达。3.CFSE增殖实验显示MSC、MSC-GFP-puro、MSC-TGF-β1与小鼠脾脏淋巴细胞体外共培养后,MSC-TGF-β1组CD3+T细胞增殖程度明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01)。ELISA检测MSC-TGF-β1组培养体系中IFN-γ浓度最低,差异具有统计学意义(p<0.01)。4.分别向 aGVHD 模型小鼠输注 MSC、MSC-GFP-puro、MSC-TGF-β1,观察其对小鼠aGVHD发病情况的影响。结果表明,MSC-TGF-β1预输注可显著改善aGVHD小鼠体重、活动度、皮肤破损等临床表现。单纯造血干细胞移植组及MSC/MSC-GFP-puro/MSC-TGF-β1与造血干细胞共移植组小鼠的中位生存期分别为26,29,28,37天,其中MSC-TGF-β1组小鼠生存期明显延长,差异具有统计学意义(p<0.01);病理学检测显示MSC-TGF-β1预输注可明显改善小鼠aGVHD的病理组织学评分。在治疗性实验部分,异基因造血干细胞移植后每周注射MSC-TGF-β1(3×105/只),连续输注5周,在更加显著改善小鼠aGVHD症状的同时可使60%的小鼠移植后生存期超过50天。5.流式结果显示,MSC-TGF-β1预防性输注可增加移植后14、21天小鼠腹腔巨噬细胞中M2型所占比例,降低移植后21天小鼠腹腔巨噬细胞中M1型所占比例,并增加移植后小鼠血液CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg所占比例。结论:TGF-β1基因修饰后的小鼠骨髓间充质干细胞能够显著增强其对小鼠异基因造血干细胞移植后aGVHD的缓解作用,其潜在作用机制可能是通过促使小鼠体内巨噬细胞向M2型极化,以及增加小鼠体内Treg细胞的比例而发挥免疫调节作用。
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