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卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是妇女常见的在40岁以前卵巢失去功能的一种疾病,有证据表明自身性免疫为卵巢早衰患者重要的病因之一。通过切除B6A新生小鼠的胸腺,可以人为制造自身免疫性卵巢早衰的动物模型。Tong等人使用抗血清筛选小鼠卵巢cDNA文库,首次在小鼠中得到自身免疫性卵巢早衰的目标抗原基因Nlrp5(又名OP1,Mater,Nalp5),并构建了Nlrp5基因敲除的小鼠模型。近年来研究发现NLRP是一个重要的蛋白家族,其典型的结构特征是具有NACHT和LRR结构域,在先天免疫(Innate immunity)和炎症(Inflammation)反应发挥重要作用,Nlrp基因在小鼠和人类染色体上均成簇排列。Nlrp5基因敲除小鼠可以正常存活,Nlrp5-/-雌鼠的卵母细胞可以正常发育、排卵和受精,但是受精卵的发育到两细胞期停滞。最新研究发现NLRP5还可作为人甲状旁腺机能减退疾病的自身抗原。神经损伤能够促进Nlrp5在神经元的转录。Li等发现小鼠卵母细胞皮质下母源复合物(Subcortical maternal complex,SCMC)至少由FLOPED、TLE6、NLRP5和FILIA四个蛋白构成,该复合体对于早期胚胎发育至关重要。然而到目前为止,人们对NLRP5甚至大部分NLRP家族成员在卵成熟和早期胚胎发育过程中参与的分子生物学机制知之甚少。
我们实验室在前期合作研究中通过全基因扫描,发现Nlrp5与小鼠自身免疫性卵巢退化(Autoimmune ovarian dysgenesis,AOD)显著相关,发现Nlrp5的转录本存在广泛的选择性剪切(Alternative splicing)现象,并报道了小鼠Nlrp5的多个选择性cDNA剪切体。为了探索NLRP5蛋白在早期发育胚胎发育中作用的分子机制,本项研究以NLRP5全序列蛋白、NACHT、LRR结构域为诱饵,利用酵母双杂交技术,分别筛选由实验室构建的小鼠卵巢cDNA文库,筛选NLRP5相互作用的蛋白,筛选到的克隆然后经过在酵母中初步验证,初步确了CNOT2、GTF2A2、Miz1、HSP40A1,HSP40C14、PP5作为和NLRP5相互作用的候选蛋白。根据文献阅读,我们进一步探索NLRP5和CNOT2可能的相互作用。CNOT2是转录抑制因子,Ccr4-Not复合体中的一个组分。Ccr4-Not是一个保守的有多个蛋白构成的细胞内调控平台,调节转录的起始、mRNA的降解、蛋白质修饰如泛素化等。
我们利用自制的CNOT2抗体检测并比较了CNOT2在Nlrp5+/+和Nlrp5-/-小鼠卵成熟和早期胚胎发育过程中的蛋白表达模式,发现CNOT2在Nlrp5+/+和Nlrp5-/-小鼠卵成熟和早期胚胎发育过程中的蛋白表达谱和细胞定位存在显著差异。在野生型小鼠中,CNOT2蛋白量在该发育过程蛋白呈动态变化,MII卵中表达量几乎检测不到,而Nlrp5-/-小鼠则没有表现出显著变化。CNOT2在野生型小鼠的卵发育和胚胎发育过程中,在细胞内分布也呈动态变化,尤其在两细胞胚胎中细胞核内分布明显低于细胞质,8细胞胚胎期时细胞核内则高于细胞质,而在Nlrp5-/-小鼠两细胞胚胎期CNOT2在细胞核内分布和细胞质内分布相似,或明显高于细胞质。从受精卵到8细胞期野生型胚胎CNOT2在皮质下均呈现出较多分布,这和包含NLRP5在内的皮质下母源复合物(SCMC)在该发育阶段细胞定位相一致。而在Nlrp5-/-小鼠受精卵和2细胞胚胎并不显示出CNOT2在皮质下相对高分布,并且在两细胞胚胎期CNOT2在细胞核内分布和细胞质内分布相似,或明显高于细胞质。CNOT2在Nlrp5野生型和Nlrp5-/-小鼠卵成熟和早期胚胎发育中蛋白量上的变化的区别、在细胞内定位上的区别暗示着CNOT2和NLRP5在该过程存在着联系,或许就是这种联系对于Nlrp5-/-小鼠卵受精后胚胎在两细胞发育停滞起到某种至关重要的作用。
在273T细胞系共表达NLRP5、EGFP融合蛋白和CNOT2、RFP融合蛋白,对比共表达CNOT2、RFP融合蛋白和EGFP蛋白,发现当共表达CNOT2、RFP融合蛋白和NLRP5、EGFP融合蛋白时,CNOT2在细胞核内的分布降低,并且荧光减弱。使用蛋白酶体抑制剂MG132可以使荧光得到恢复。在CHO和3T3细胞系共表达CNOT2和NLRP5观测到和在293T细胞系共表达CNOT2和NLRP5类似的现象。在细胞系内异位表达NLRP5和CNOT2的观测结果暗示可能由于CNOT2和NLRP5相互作用造成CNOT2在细胞核内分布减少,这种可能的相互作用又造成了蛋白通过蛋白质泛素化蛋白酶体途径降解。为了检测这两个蛋白是否存在相互作用,我们发现在抗CNOT2抗体免疫沉淀的野生型小鼠卵巢裂解物中可以检测到NLRP5,同样的在抗NLRP5抗体免疫沉淀的野生型小鼠卵巢裂解物中可以检测到CNOT2,表明NLRP5和CNOT2间存在相互作用。