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骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)是成体干细胞中的一种,具有多项分化潜能和较强的自我更新能力,同时又因为其具有易于分离培养和取材方便等特点,因此可作为骨科疾病治疗、修复受损骨以及组织工程中完美的再生细胞。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)具有能够诱导MSCs向成骨分化的能力,其中BMP9是目前研究发现诱导成骨能力最强。Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物等多种动物体内,是一条保守的信号通路,在生物胚胎期以及出生后的整个发育过程中都发挥着重要调控作用。对多种细胞系的增殖、分化、凋亡、粘附以及表皮细胞向间质转化都有一定调控作用。有研究证实,在MSCs成骨分化过程,Notch信号通路参与了调控作用。课题组前期研究证明,Notch信号通路能够促进BMP9诱导MSCs向成骨分化,但具体机制尚未明确。DLL1是Notch信号通路的一种配体,目前有研究报道,在胶质瘤中,DLL1可能通过阻滞细胞分化来促进细胞增殖；但在黑色素瘤中,DLL1能够调节胚胎动静脉分化以及成体损伤后的血管再生与修复。但目前还没有研究报道DLL1对成骨分化作用的具体影响与机制。第一部分实验主要研究目的：探究DLL1在BMP9诱导MSCs向成骨分化的作用；研究发现DLL1促进BMP9诱导的MSCs成骨分化；在这个过程中,DLL1明显上调BMP9的受体ALK2表达,而BMP9其余受体并没有明显变化；同时,我们发现Notch信号通路抑制剂DAPT和dnNotch1作用后都出现同样的调节ALK2表达的现象。因此,我们在第二部分着重研究,Notch信号通路是否通过上调ALK2影响BMP9诱导MSCs的成骨分化。第一部分DLL1在BMP9诱导MSGs成骨分化中的作用目的：了解Notch配体Delta-like1(DLL1)在BMP9诱导的MSCs成骨分化的作用及可能机制。方法：采用重组腺病毒分别上调BMP9,及DLL1,采用细胞化学染色分别检测早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和晚期成骨指标茜素红染色,了解DLL1在体外对BMP9诱导的成骨分化的影响；同时,通过裸鼠异位成骨实验,mcroCT和HE染色,分析DLL1在体内对BMP9诱导成骨分化的作用。另一方面,qRT-PCR检测BMP9受体的表达情况,Western检测p-Smad1/5/9和荧光素报告酶检测Smad结合元件(Smad-binding element, SBE)活性,分别从胞膜、胞浆和胞核三个水平了解DLL1对BMP9信号通路的影响,以了解DLL1促进BMP9诱导成骨分化的可能机制。结果：DLL1处理组与对照组相比,前者在体外能明显促进BMP9诱导的MSCs的ALP及钙盐沉积；在体内亦能促进裸鼠皮下成骨；在这一过程中,DLL1处理后,BMP9的受体ALK2明显上调；Smad1/5/8蛋白总量没有改变,p-Smad1/5/9蛋白表达水平升高,而SBE活性也有升高(P<0.05)。结论：DLL1在体内外都能够促进BMP9诱导MSCs成骨能力；在细胞膜、细胞浆及细胞核三个水平,对BMP9-Smad经典信号通路都有作用。第二部分Notch信号通路通过上调ALK2促进BMP9诱导MSCs成骨分化目的：了解Notch信号通路是否是通过上调BMP9受体ALK2促进BMP9诱导的MSCs成骨分化作用。方法：分别采用重组腺病毒DLL1和BMP9上调Notch和BMP9, DAPT和重组腺病毒dnNotch1下调Notch,重组腺病毒siALKl和2下调ALK1和ALK2。分组处理MSCs细胞后,RT-PCR/qRT-PCR检测受体表达情况；细胞化学法检测早晚期成骨指标；流式细胞术检测细胞周期以及凋亡情况；Edu检测细胞增殖。结果：BMP9诱导成骨过程中,上调/下调Notch,能引起ALK2,而不是ALK1表达量的变化；DLL1能逆转由于干扰ALK2导致的早晚期成骨分化指标的减弱,但对siALK1处理组没有影响；流式细胞分析和Edu实验显示DLL1能逆转由于干扰ALK2导致的减少的细胞增殖(P<0.05),而对siALK1处理组没有影响；但对细胞凋亡并无明显影响。结论：在BMP9诱导的成骨分化过程中,Notch信号通路可能通过上调ALK2的表达,影响细胞增殖,从而促进MSCs成骨分化。