【摘 要】
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结核病是由结核分枝杆菌引起的一种全球性传染疾病,每年会导致数百万人死亡。巨噬细胞是结核感染后免疫系统的第一道防线,当结核入侵后,经过剧烈的免疫反应,部分结核分枝杆菌通过免疫逃逸,持续滞留感染（PBI,persistent bacterial infection）巨噬细胞,形成长期的共生关系。在结核分枝杆菌与宿主细胞复杂的免疫互作过程中,有个亟需解答的问题:结核分枝杆菌能否调控宿主的表观修饰?又是如
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结核病是由结核分枝杆菌引起的一种全球性传染疾病,每年会导致数百万人死亡。巨噬细胞是结核感染后免疫系统的第一道防线,当结核入侵后,经过剧烈的免疫反应,部分结核分枝杆菌通过免疫逃逸,持续滞留感染（PBI,persistent bacterial infection）巨噬细胞,形成长期的共生关系。在结核分枝杆菌与宿主细胞复杂的免疫互作过程中,有个亟需解答的问题:结核分枝杆菌能否调控宿主的表观修饰?又是如何调控宿主的表观修饰,从而抵抗宿主细胞免疫应答,达到潜伏感染的目的。基因的表型是由基因组序列信息和基因组表观修饰共同决定的。组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化以及基因组DNA甲基化等修饰可以在基因组序列不变的前提下调控目的基因的表达。随着表观组学的发展,人们发现这些线性的表观修饰信息可以通过基因组空间折叠串联在一起,形成高级的三维结构,相互作用,共同影响基因的表型。基因组三维结构在DNA复制,DNA损伤修复,以及基因转录调控中扮演着重要的角色。人类基因组百科全书计划（ENCODE Project）对数百万个基因调控元件进行了详细的注释,但是这些离散的元件如何在空间中发生相互作用很多都是未知的。通过研究,人们发现基因组会通过三维折叠,将两个线性距离很远的调控元件关联在一起,激活或者抑制某些基因的表达。因为基因组三维结构的重要性,美国国立卫生研究院（NIH）已经启动了四维染色质计划（4D Nucleome Project）,研究基因组三维结构在不同时间,不同状态下的动态变化。Hi-C技术作为研究染色体三维结构的主要工具,从提出到现在应用十分广泛,让人们对表观修饰的认识深入到了一个新的阶段,但是一些技术上的缺陷限制了Hi-C技术的普及,包括:实验步骤繁多、成功率低、成本高、缺少随机连接噪音评价标准、数据分析难度大等。为了克服Hi-C技术上的缺陷,本课题发明了一种简单、高效、成本低廉的染色体构象捕获技术,DLO Hi-C（Digestion-Ligation-Only Hi-C）。该技术只需要两步简单的酶切酶连即可进行染色质构象捕获实验,为了降低实验成本及数据背景噪音,DLO Hi-C在建库过程中去掉了生物素标记的步骤,通过回收固定大小的互作DNA片段来捕获染色体的互作信息。创新性的,由于我们加入了文库质检的步骤,DLO Hi-C文库构建完成后,只需要一步简单的酶切即可判断文库随机连接噪音的大小,大大的缩短了测序时间周期。为了深入研究结核分枝杆菌潜伏感染对宿主细胞表观修饰的影响,我们建立了单核细胞THP-1分化及感染模型。在三维基因组层面上,我们通过DLO Hi-C实验,捕获了单核细胞、巨噬细胞、结核感染巨噬细胞这三种细胞状态下染色质三维构象信息。在组蛋白修饰层面上,通过ChIP-seq实验,分析了单核细胞分化及结核感染过程中,H3K4me1,H3K4me3,H3K9me3,H3K27ac 以及 H3K27me3 这 5 种组蛋白表观修饰的动态变化。对于基因组“开放”和“闭合”情况,我们利用ATAC-seq对三种细胞状态基因组“open”和“close”的区域进行了详细的划分。通过多组学联合分析,我们找到了 186个在各个表观层面上都有变化的差异基因,这些候选基因对我们后期的抗肿瘤以及抗结核药物的研发有着积极的意义,也对结核易感基因的发掘做出了参考。
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