论文部分内容阅读
目的:复制大鼠胫骨中段骨折模型,探究三种甲壳质衍生物(N-乙酰氨基葡萄糖、壳寡糖、壮骨液)对大鼠骨折愈合的作用和机制。方法:手术制备大鼠胫骨中段骨折模型,实验设计为甲壳质衍生物处理组(N-乙酰葡萄糖组、壳寡糖组、壮骨液)和模型组,于骨折术后7d、14d、21d,X线摄片和Alcian blue/HE学染色观察骨折后骨骼愈合的组织学变化;免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA);位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测骨折后细胞凋亡率;酶生化法检测血液中钙、、磷离子浓度和碱性磷酸酶(Alcoline phospharase,ALP)活性;大鼠成骨细胞MC3T3-E1培养液中加入200-1000ng/ml壳寡糖孵育24h,MTT法、Hoest染色法和RT-PCR法分别检测细胞增殖、凋亡及细胞中ALP和骨钙素mRNA的表达。结果:大鼠骨折后7d、14d、21d,甲壳质衍生物治疗组中壳寡糖和壮骨液组骨痂生长愈合早于N-乙酰氨基葡萄糖组和模型组,骨痂中小梁骨占骨痂总面积的百分比高于模型组(p<0.05),而纤维和软骨成分低于模型组(p<0.05)。骨折后7d,PCNA阳性细胞数量达最高峰,但不同处理组问差别无显著性(p>0.05);骨折后14d开始,壳寡糖和壮骨液治疗组PCNA阳性细胞数量高于模型组(p<0.05);21d时其PCNA阳性细胞数量低于模型组(p<0.05)。TUNEL染色结果表明,骨折后14d为新形成的软骨细胞和骨痂中的成骨细胞凋亡最高峰;各时间段壳寡糖和壮骨液组TUNEL阳性细胞数均少于模型组(p<0.05)。骨折后14、21d壳寡糖和壮骨液组血钙浓度和ALP活性明显高于模型组(P<0.05),血磷浓度高于模型组(P<0.05)。体外实验中MTT结果显示,壳寡糖孵育MC3T3-E1细胞组OD值显著增高,且呈浓度依赖性(P<0.01)。壳寡糖浓度为400-1000μg·mL-1能剂量依赖性地抑制MC3T3-E1细胞凋亡,提高ALP、骨钙素mRNA表达(P<0.05)。结论:三种甲壳质衍生物均可促进大鼠胫骨骨折愈合,其机制与促进骨折部位骨细胞增殖、抑制细胞凋亡、提高血钙磷浓度和ALP活性有关;壳寡糖剂量依赖性增强MC3T3-E1细胞增殖,抑制凋亡,提高细胞ALP、Osteocalcin mRNA表达促进细胞早中期分化。