心肾综合征指心脏与肾脏之间相互影响的复杂的病理生理学紊乱状态。心脏与肾脏中的任一器官发生急慢性功能不全都将导致另一器官的急慢性功能不全,形成恶性循环,最终导致两个脏器的衰竭。尽管近年来心肾疾病诊疗技术获得了快速发展,但以心肾综合征为终末阶段的临床不良事件仍呈稳步上升趋势,已经成为一个重要的社会公共卫生问题。慢性肾脏病与心血管疾病之间存在紧密的联系。与普通人群相比,心血管疾病在慢性肾脏病患者中具有较高的患病率与较差的预后。反之,心血管疾病也是透析患者死亡的主要原因,因心血管疾病死亡的人数约为透析人群中总死亡人数的40-50%。目前的研究认为慢性肾脏病是心血管疾病的主要危险因素之一,肾小球率过滤降低和蛋白尿均是心血管疾病的独立危险因素。在动物实验中也已证明肾功能不全可在体内促进心力衰竭和动脉粥样硬化的发生发展。这些研究显示慢性肾脏病可以促进心力衰竭和冠心病等心血管疾病的发生发展,但具体机制仍未完全明确。硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate, IS)和硫酸对甲酚(p-cresyl sulfate, PCS)都是肠道食物蛋白来源的蛋白质结合类尿毒症毒素。在慢性肾脏病患者中,IS和PCS随着肾功能的减退而在患者体内不断蓄积,产生对机体的损害作用。在慢性肾脏病患者中,IS和PCS的血清浓度均与慢性肾脏病进展、主要不良心血管事件、心血管死亡率和全因死亡率相关。因此,IS和PCS可能是慢性肾脏病中促进慢性肾脏病和心血管疾病进展的重要因素,但其具体机制仍未完全明确。肾小球硬化、心室重塑和动脉粥粥样硬化分别是慢性肾衰竭、慢性心力衰竭和冠心病的主要病理生理学改变。因此,进一阐明确IS和PCS对肾脏纤维化、心室重塑和动脉粥粥样硬化的影响及机制对心肾综合征的防治具有重要意义。综合既往研究结果,本课题发现以下急需进一步明确的关键科学问题：(1)IS和PCS能否促进肾小球系膜细胞胶原合成肾脏纤维化是几乎所有类型慢性肾脏病晚期的共同病理学改变,是导致慢性肾功能衰竭和终末期肾病的主要原因。肾脏纤维化以肾小球硬化和肾小管间质纤维化为主要特征。既往研究显示IS和PCS均可在体外诱导肾小管细胞损伤、衰老、炎症因子表达,在体内促进肾间质纤维化,但它们对肾小球硬化的影响及机制仍未明确。肾小管系膜细胞合成细胞外基质(尤其是胶原蛋白)增加是肾小球硬化的主要病理生理学机制之一。但目前IS和PCS对肾小球系膜细胞合成细胞外基质和胶原蛋白的影响仍然未知。(2)PCS能否产生与IS类似的促心肌细胞肥大及心肌纤维化作用心室重塑是多种心血管病后期的主要病理生理学改变,是导致心力衰竭的主要原因；心肌细胞肥大与心肌纤维化是左室重塑和左室肥厚的主要病理学改变。既往研究显示IS可在体外直接刺激心肌细胞肥大和心肌纤维化,但PCS对心肌细胞肥大和心肌纤维化的影响仍然未知。(3)Is能否通过增加巨噬细胞摄取氧化低密度载脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, Ox-LDL)研究显示Is的血清浓度与冠心病患者冠脉病变严重程度和危险因素相关,并可能通过损伤血管内皮细胞皮的功能及修复和促进血管平滑肌细胞增值与迁移参与慢性肾脏病中动脉粥样硬化的发生发展。目前的研究认为动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,单核／巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生发展中起关键作用,尤其巨噬细胞摄取Ox-LDL进而形成泡沫细胞是动脉粥样硬化形成早期的关键步骤。但IS是否促进促进巨噬细胞摄取Ox-LDL仍然未知。为了进一步明确上述科学问题和深入探讨心肾综合征发生病理生理学机制,本课题分以下三部分展开研究：第一部分IS和PCS对大鼠肾小球系膜细胞胶原合成的影响及机制[研究目的]研究IS和PCS对肾小球系膜细胞胶原合成的影响,及有机阴离子转运蛋白1/3(organic anion transporter1/3, OAT1/3)和凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase1, ASK1)、P38、ERK1/2、NFκB信号转导通路在其中的作用。[研究内容与方法]体外培养大鼠肾小球系膜细胞系(RMC)细胞。将RMC细胞用0.0001-300μMIS或PCS刺激48小时,或者0.1-100μM OAT1/3拮抗剂丙磺舒、0.03-1.0μMASK1抑制剂G2261818A (G226)、0.1-3.0μM p38抑制剂RWJ-67657(RWJ)和0.03-1.0μM MEK1/2(ERK1/2上游)抑制剂U0126预处理2小时后与10μM IS或100μM PCS共同刺激48小时,用3H-脯氨酸掺入法检测RMC胶原合成和MTT法检测细胞活力。用Western Blot法检测10μMIS或100μMPCS刺激15分钟,以及100μM丙磺舒、1μM G226、3μM RWJ或1μM U0126预处理2小时后与10μM IS或100μM PCS共刺激15分钟对RMC细胞内ASK1、p38、ERK1/2和NFκB蛋白表达量的影响。统计学分析使用Prism6统计软件,用Brown-Forsythe检验进行方差齐性检验；如数据满足方差齐性,所有指标多组间比较分析均采用单因素方差分析法(one-way ANOVA),组间多重比较采用Newman-Keuls检验；如不满足方差齐性,多组间比较则采用Kruskal-Wallis检验,组间多重比较则采用Dunn’s检验。结果以(?)±s表示,P<0.05认为差异有统计学意义。[研究结果]IS对RMC细胞胶原合成及细胞活力的影响与对照组相比,0.0001μM-300μM的工S刺激48小时组均可增加RMC细胞胶原合成(增幅最高达30.12%),差异均有显著性意义(P均<0.05)。0.1-100μM丙磺舒(P均<0.001)、0.03-1.0μMG226(P均<0.0001)、0.1-3.0μMRWJ(P均<0.0001)或0.03-1.0μMU0126(P均<0.001)预处理均可抑制10μMIS诱导的RMC细胞胶原合成增加,差异均有显著性意义。此外,0.0001-300μMIS刺激48小时(P=0.4856),以及0.1-100μ M丙磺舒(P=0.3871)、0.03-1.0μMG226(P=0.6521)、0.1-3.0μMRWJ(P=0.5744)和0.03-1.0μM U0126(P=0.6989)预处理均对RMC细胞均无显著影响。PCS对RMC细胞胶原合成及细胞活力的影响与对照组相比,0.0001μ M-300μM的PCS刺激48小时均可增加RMC细胞内胶原合成(增幅最高达31.33%),差异均有显著性意义(P均<0.001)。0.1-100μM丙磺舒(P均<0.001)、0.03-1.0μMG226(P均<0.0001)、0.1-3.0μMRWJ(P均<0.0001)或0.03-1.0μMU0126C(P均<0.001)预处理均可抑制100μMPCS诱导的RMC细胞胶原合成增加,差异均有显著性意义。此外,0.0001-300μM PCS刺激48小时(P=0.1183),以及0.1-100μM丙磺舒(P=0.8869)、0.03-1.0μMG226(P=0.9653)、0.1-3.0μMRWJ(P=0.1357)和0.03-1.0μM U0126(P=0.7665)预处理均对RMC细胞均无显著影响。IS可直接激活RMC细胞内ASK1、p38、ERK1/2%NFκB信号转导通路(1)IS以及丙磺舒、G226预处理对RMC细胞内蛋白表达的影响与对照组相比,10uMIS刺激15分钟可增加RMC细胞内ASK1、p38、ERK1/2和NFκB的磷酸化蛋白表达,而100μM丙磺舒、1μMG226预处理可以抑制10μM IS诱导的ASK1、p38、ERK1/2和NFκB磷酸化蛋白表达增加,差异均有显著性意义(磷酸化ASK1检测中P均<0.01,磷酸化p38检测中P均<0.05,磷酸化ERK1/2检测中P均<0.0001,磷酸化NFκB检测中P均<0.01)。在总p38(P=0.7452)、总ERK1/2(P=0.2020)、总NFκB(P=O.6307)和Pan-actin(P=0.1049)的蛋白表达量检测中,不同组间差异均无显著性意义。(2)IS以及RWJ、U0126预处理对RMC细胞内蛋白表达的影响与对照组相比,10μM IS刺激15分钟可增加RMC细胞内p38. ERK1/2和NF κ B的磷酸化蛋白表达,而3μM RWJ和1μM U0126预处理可分别抑制10μM IS诱导的p38和ERK1/2的磷酸化蛋白表达增加,二者均可抑制10μM IS诱导的NFκB磷酸化蛋白表达增加,差异均有显著性意义(磷酸化p38检测中P均<0.01,磷酸化ERK1/2检测中P均<0.05,磷酸化NFκB检测中P均<0.05)。在总p38(P=0.3756)、总ERK1/2(P=0.5219)、总NFκB(P=0.7976)和Pan-actin(P=0.6185)的蛋白表达检测中,不同组间差异均无显著性意义。PCS可直接激活RMC细胞内ASK1、p38、ERK1/2、NFκB信号转导通路(1)PCS以及丙磺舒、G226预处理对RMC细胞内蛋白表达的影响与对照组相比,100μMPCS刺激15分钟可增加RMC细胞内ASK1、p38、ERK1/2和NFκB的磷酸化蛋白表达增加,而100μM丙磺舒和1μ M G226预处理均可抑制100μM PCS诱导的ASK1、p38、ERK1/2和NFκB磷酸化蛋白表达增加,差异均有显著性意义(磷酸化ASK1检测中P均<0.05,磷酸化p38检测中P均<0.01,磷酸化ERK1/2检测中P均<0.01,磷酸化NFκB检测中P均<0.01)。在总p38(P=0.9452)、总ERK1/2(P=0.4724)、总NFκB(P=0.5700)和Pan-actin(P=0.8744)的蛋白表达量检测中,不同组间差异均无显著性意义。(2)PCS以及RWJ、U0126预处理对RMC细胞内蛋白表达的影响与对照组相比,100μM PCS刺激15分钟可增加RMC细胞内p38、ERK1/2和NFκB的磷酸化蛋白表达,而3μMRWJ和1μMU0126预处理可分别抑制100μM PCS诱导的p38和ERK1/2磷酸化蛋白表达增加,二者均可抑制100μM PCS诱导的NFκB磷酸化蛋白表达增加,差异均有显著性意义(磷酸化p38检测中P均<0.01,磷酸化ERK1/2检测中P均<0.001,磷酸化NFκB检测中P均<0.01)。在总p38(P=0.0962)、总ERK1/2(P=0.6135)、总NFκB(P=0.4989)和Pan-actin(P=0.8488)的蛋白表达量检测中,不同组间差异均无显著性意义。[研究结论]IS和PCS均可在体外直接刺激RMC胶原合成增加；该作用至少部分通过OAT1/3摄取IS和PCS进入细胞以及激活ASK1、MAPK (p38、ERK1/2)和NFκB信号转导通路产生。PCS和IS可能部分通过OAT1/3-ASK1-MAPK (p38、ERK1/2)-NFκB信号轴促进肾小球系膜细胞胶原合成,从而参与慢性肾脏病肾小球硬化的进展。第二部分PCS对乳鼠心肌细胞肥大和心肌脏成纤维细胞胶原合成的影响及机制[研究目的]研究PCS对乳鼠心脏成纤维细胞胶原合成和心肌细胞肥大的影响,及OAT1/3和ASK1、P38、ERK1/2、NFκB信号转导通路在其中的作用。[研究内容与方法]体外培养原代乳鼠心肌细胞肥和心脏成纤维细胞。将乳鼠心脏成纤维细胞和心肌细胞用0.0001-300μM PCS刺激48小时,或者0.1-100μM丙磺舒、0.03-1.0μ M G226、0.1-3.0μ M RWJ和0.03-1.0μM U0126预处理2小时后与100uMPCS共同刺激48小时,用3H-脯氨酸掺入法检测心脏成纤维细胞胶原合成,用3H-亮氨酸掺入法检测心肌细胞肥大,用MTT法检测细胞活力。乳鼠心肌细胞经100μM PCS刺激15分钟,以及100μM丙磺舒、1μM G226、3μM RWJ或1μM U0126预处理2小时后与10μM IS或100μM PCS共刺激15分钟,用Western Blot法检测细胞内ASK1、p38、ERK1/2和NFκB蛋白表达量。统计学分析同第一部分。[研究结果]PCS对乳鼠心脏成纤维细胞胶原合成和细胞活力的影响在0.0001-300μM PCS对乳鼠心脏成纤维细胞胶原合成影响的检测中,不同组间差异无显著性意义(P=0.1017)。在0.0001-300μM PCS对乳鼠心脏成纤维细胞活力的检测中,不同组间差异无显著性意义(P=0.0905)PCS对乳鼠心肌细胞肥大和细胞活力的影响与对照组相比,0.0001-300μM PCS刺激48小时均可促进乳鼠心肌细胞肥大(增幅最高达31.70%),差异均有显著性意义(P均<0.001)。0.1-100μM丙磺舒(P均<0.001)、0.03-1.0μMG226(P均<0.001)、0.1-3.0μM RWJ(P均<0.01)或0.03-1.0μM U0126(P匀<0.0001)预处理均可抑制100μM PCS诱导的乳鼠心肌细胞肥大,差异均有显著性意义。此外,0.0001-300μM PCS刺激48小时(P=0.9553),以及0.1-100μM丙磺舒(P=0.1540)、0.03-1.0μMG226(P=0.4404)、0.1-3.0μMRWJ(P=0.7696)或0.03-1.0μM U0126(P=0.6121)预处理均对乳鼠心肌细胞活力无显著影响。PCS可直接激活乳鼠心肌细胞内ASK1、p38、ERK1/2信号转导通路(1)PCS以及丙磺舒、G226预处理对乳鼠心肌细胞内蛋白表达的影响与对照组相比,100μM PCS刺激组15分钟可增加乳鼠心肌细胞内ASK1、p38和ERK1/2的磷酸化蛋白表达增加,100μM丙磺舒或1μM G226预处理均可抑制100μM PCS诱导的ASK1、p38、ERK1/2磷酸化蛋白增加,差异均有显著性意义(磷酸化ASK1检测中P均<0.05,磷酸化p38检测中P均<0.05,磷酸化ERK1/2检测中P均<0.005)。在磷酸化NFκB(P=0.2040)、总NFκB(P=0.9714)、总p38(P=0.9784)、总ERK1/2(P=0.3534)和Pan-actin(P=0.4384)的蛋白表达检测中,不同组间量差异均无显著性意义。(2)PCS以及RWJ, U0126预处理对乳鼠心肌细胞内蛋白表达的影响与对照组相比,100μM PCS刺激15分钟可增加乳鼠心肌细胞内p38和ERK1/2的磷酸化蛋白表达,而3μM RWJ和1μ M U0126预处理可分别抑制100μMPCS诱导的p38和ERKl/2蛋白表达增加,差异均有显著性意义(磷酸化p38检测中P均<0.01；磷酸化ERK1/2检测中P均<0.001)。在磷酸化NFκB(P=0.2111)、总NFκB(P=0.7808)、总p38(P=0.6670)、总ERK1/2(P=0.1287)和Pan-actin(P=0.1619)的蛋白表达量检测中,不同组间差异均无显著性意义。[研究结论]PCS可在体外直接刺激乳鼠心肌细胞肥大；该作用至少部分通过OAT1/3摄取PCS进入细胞以及激活ASK1、MAPK (p38、ERK1/2)信号转导通路产生。PCS在体外对乳鼠心脏成纤维细胞胶原合成无显著影响。PCS可能部分通过OAT1/3-ASK1-MAPK (p38、ERK1/2)信号转导通路促进乳鼠心肌细胞肥大,从而参与慢性肾脏病中心室重塑的进展。第三部分IS对THP-1源性巨噬细胞摄取Ox-LDL的影响及机制[研究目的]研究IS对THP-1源性巨噬细胞摄取Ox-LDL的影响及机制。[研究内容与方法]体外培养THP-1细胞,并用氟波酯刺激72小时诱导其形成THP-1源性巨噬细胞。将THP-1源性巨噬细胞经1-500μM不同浓度IS刺激24小时以及在5μM U0126预处理2小时后与250μM IS共同刺激24小时;或者经250μM IS刺激12、24、36、48小时；用Dil-Ox-LDL掺入法(Dil-Ox-LDL在细胞培养的最后4小时加入细胞培养基中)检测THP-1源性巨噬细胞的Ox-LDL摄取能力,用CCK-8法检测细胞活力。将THP-1巨噬细胞用250μM IS刺激15分钟以及5μM U0126预处理2小时与250μMIS共同刺激15分钟,用Western Blot法检测细胞内磷酸化及总ERK1/2的蛋白表达。统计学分析同第一部分。[研究结果]IS对THP-1源性巨噬细胞摄取Ox-LDL的浓度效应与对照组相比,1μM和10μM IS刺激组Dil-Ox-LDL摄入量无显著性差异(P均>0.05)；100μM.250μ M和500uMIS刺激24小时可分别增加Dil-Ox-LDL摄入量28.05%、40.57%和61.26%,差异均有显著性意义(P均<0.0001)；与250μM IS刺激组相比,5μM U0126预处理可抑制IS诱导的Dil-Ox-LDL摄入量增加,差异有显著性意义(P<0.0001)。IS对THP-1源性巨噬细胞摄取Dil-Ox-LDL的时间效应与对照组相比,250μMIS刺激12、24、36和48小时可分别增加Dil-Ox-LDL摄入量27.35%、48.34%、70.82%和95.05%,差异均有显著性意义(P均<0.0001)。THP-1源性巨噬细胞活力检测在IS对THP-1源性巨噬细胞活力的浓度效应(P=0.1525)和时间效应(P=0.4991)检测中,不同组间差异均无显著性意义。IS对THP-1源性巨噬细胞内ERK1/2信号转导通路的影响与对照组相比,250μM IS刺激15分钟可增加磷酸化ERK1/2的表达,5u M U0126预处理可抑制250μM IS诱导的磷酸化ERK1/2表达增加,差异均有显著性意义(P均<0.0001)。在总ERK1/2蛋白表达量检测中,不同组间差异无显著性意义(P=0.6431)。[研究结论]IS可在体外呈浓度依赖性和时间依赖性直接刺激THP-1源性巨噬细胞摄Ox-LDL增加,该作用至少部分通过激活ERK1/2信号转导通路产生,提示IS可能参与促进慢性肾脏病中动脉粥样硬化的发生发展。