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第一部分结直肠癌组织中miR-506的表达及临床病理意义目的:研究结直肠癌组织的miR-506表达水平,并研究结直肠癌耐药细胞中miR-506表达水平,探讨miR-506与结直肠癌临床病理相关性。方法:收集了49例结直肠癌和相应的癌旁组织,采用荧光检测法(q RT-PCR)对miR-506表达进行检测,并利用卡方检验对肿瘤组织样本中miR-506的表达量与病理参数之间的相关性进行分析。用梯度药物法筛选出结直肠癌耐西妥昔单抗细胞HCT-116/Cetuximab,再检测结直肠癌耐西妥昔单抗细胞中miR-506表达量。结果:实时荧光定量PCR检测结果显示,与癌旁组织相比,结直肠癌组织miR-506表达显著下调。miR-506表达水平与病理参数之间的相关性分析结果显示,miR-506的表达量与结直肠癌肿瘤大小、临床分期以及淋巴结转移有显著相关性(p<0.05)。同时,实时荧光定量PCR检测结果显示:结直肠癌耐西妥昔单抗细胞中miR-506表达显著下调(p<0.05)。结论:(1)miR-506在结直肠癌中表达下调。(2)miR-506表达水平与肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移之间密切相关。(3)miR-506在结直肠癌耐西妥昔单抗细胞中的表达下调。第二部分miR-506对结直肠癌干细胞增殖和自我再生能力的相关性目的:研究结、直肠癌干细胞中miR-506表达水平,阐明miR-506对结直肠肿瘤干细胞的增殖和自我再生能力的影响。方法:磁珠分选法富集分离CD44+CD133+HCT-116细胞(HCT-116 CSCs),并利用流式细胞术检测其细胞表型,利用q RT-PCR法检测HCT-116 CSCs中miR-506表达水平。构建miR-506 mimics以及对照mimics(NC)慢病毒载体,包装慢病毒后感染结直肠癌干细胞HCT-116 CSCs,分别建立了稳定转染的细胞株。利用q RT-PCR法验证稳定转染的细胞株中miR-506的表达,利用CCK8法检测各组HCT-116 CSCs的增殖能力,平板克隆形成实验检测HCT-116 CSCs自我更新能力;并利用q RT-PCR检测HCT-116 CSCs干细胞相关因子Sox2和Oct4 RNA表达水平。结果:流式细胞术检测结果表明,分离的HCT-116 CSCs其CD44+CD133+细胞比例达到97%,符合肿瘤干细胞特征。q RT-PCR结果显示,HCT-116 CSCs中miR-506表达显著下调。q RT-PCR结果显示,在HCT-116 CSCs中,miR-506 mimics组中miR-506的表达水平高于对照组NC,他们之间差异有统计学意义(p<0.001)。CCK8检测结果表明,在12、24和48h时,miR-506 mimics组HCT-116 CSCs细胞的增殖能力较对照组NC显著降低(p<0.01)。平板克隆形成实验:miR-506 mimics组HCT-116 CSCs细胞自我更新能力较对照组NC显著降低(p<0.01)。q RT-PCR检测结果显示,miR-506 mimics组HCT-116 CSCs细胞中干细胞相关因子Sox2和Oct4 RNA表达水平显著降低(p<0.01)。结论:(1)磁珠法成功分离出CD44CD133HCT-116 CSCs;(2)miR-506在结直肠癌干细胞HCT-116 CSCs中低表达;(3)miR-506能够抑制HCT-116 CSCs增殖和自我更新能力;(4)miR-506能够抑制HCT-116 CSCs干细胞相关因子RNA表达。第三部分miR-506抑制结直肠癌干细胞增殖和自我更新的分子机制目的:探讨miR-506在调节结直肠癌干细胞增殖和自我更新的可能靶基因及其分子机制。方法:利用miRNA靶基因预测数据库预测NOTCH1为miR-506调控结直肠癌干细胞增殖和自我更新可能的靶基因。NOTCH1野生型(WT)和突变型(MUT)重组,并移植到PSICHECK质粒上,转染稳定表达miR-506 mimics结直肠癌HCT-116细胞。同时,采用双荧光素酶基因报告系统(Double luciferase gene reporting system,DLGRS)对靶基因NOTCH1进行验证。利用western blot检测了NC、miR-506 mimics和miR-506 inhibitor细胞株中NOTCH1的蛋白表达量,并检测了结直肠癌干细胞HCT-116 CSCs和结直肠癌耐西妥昔单抗细胞HCT-116/Cetuximab中NOTCH1的蛋白表达量,将NOTCH1过表达载体转染miR-506 mimics结直肠癌HCT-116细胞,western blot验证结直肠癌干细胞中NOTCH1的蛋白表达,利用CCK8和平板克隆形成检测NOTCH1对细胞增殖和自我更新能力的影响。结果:DLGRS检测结果为:与对照组相比,WT NOTCH1 3`UTR组荧光强度大幅下降,两组差异有统计学意义(p<0.01),而MUT NOTCH1 3`UTR组无明显变化。Western blot结果显示:与NC比较,miR-506 mimics中NOTCH1表达显著降低,miR-506 inhibitor中NOTCH1的表达水平升高;与HCT-116 non-CSCs比较,HCT-116 CSCs中NOTCH1的表达水平显著升高;与HCT-116细胞比较,HCT-116/Cetuximab细胞中NOTCH1的表达水平显著升高。q RT-PCR检测结果表明,NOTCH1过表达载体的转染能够促进HCT-116 CSCs中NOTCH1的表达。CCK8检测结果表明,对比miR-506过表达(miR-506 mimics)组,NOTCH1和miR-506均过表达(miR506+NOTCH1)组细胞增殖显著增加。平板克隆形成实验:对比miR-506过表达(miR-506 mimics)组,NOTCH1和miR-506均过表达(miR506+NOTCH1)组细胞自我更新能力显著增强。结论:(1)miR-506与NOTCH1 3`UTR存在直接相互作用。(2)NOTCH1在HCT-116 CSCs和HCT-116/Cetuximab中表达上调,与miR-506的表达呈负相关。(3)NOTCH1的过表达抑制miR-506 mimics对增殖和自我更新的影响。(4)miR-506利用调节NOTCH1调节结直肠癌干细胞的增殖和自我更新