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目的结核病严重危害着人类健康,而唯一获批的疫苗卡介苗不能提供长期有效的保护作用,迫切需要研制结核病的新一代疫苗。亚单位疫苗因抗原和佐剂的组成成份均较为明确、安全性良好,被认为是非常有前景的候选疫苗类型。课题组前期已构建一种结核病新型亚单位疫苗A1D4/DMT,并证实其免疫小鼠可提供抵抗结核分枝杆菌感染的保护能力,保护水平与卡介苗相当。但是,佐剂DMT的组成成份受国外专利技术保护,难以在国内实现《药品生产质量管理规范》（Good manufacturing practice,GMP）生产,且国内无相应佐剂的替代品,阻碍了该亚单位疫苗进入临床前和临床研究。急需研发可替代DMT的Th1型细胞免疫反应佐剂。课题组前期进一步证实脂质体不仅可有效保护和递送抗原,还具有免疫调节作用,是值得开发的疫苗佐剂系统。卡介苗用于结核病的预防已有一百年的历史,免疫接种新生儿的累积接种剂量超过30亿,安全性高。卡介苗的DNA和细胞壁等成份是抗原提呈细胞表面模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）的有效激动剂,以此为基础可建立新型具有自主知识产权的佐剂系统。本研究拟探索从卡介苗提取相关成份,联合脂质体制备新型佐剂,评价其用于结核病亚单位疫苗的潜力,为推动A1D4亚单位疫苗进行临床前和临床研究奠定科学基础。方法1.A1D4蛋白的纯化和定量:使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导转入p ET-30b-A1D4质粒的大肠杆菌BL21菌株表达目的蛋白。尿素变性条件下纯化A1D4蛋白,并经梯度透析复性。去除A1D4蛋白中的内毒素后,聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate,BCA）法测定蛋白浓度。2.佐剂及疫苗制备:苯酚抽提法提取卡介苗DNA,并使用多功能酶标仪测定浓度。卡介苗菌体经磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）洗涤后,物理破碎,并去除未破碎的菌体。高速离心收集得到的沉淀经PBS洗涤后即卡介苗细胞壁（Cell wall,CW）粗提取物。冷冻干燥后,称重定量。脂膜水化法制备二油酰磷脂酰胆碱（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC）/胆固醇（Cholesterol,Chol）脂质体,并命名为DC脂质体。DC脂质体分别与提取的卡介苗DNA和细胞壁混合,得到新型佐剂DCBD和DCBC。佐剂进一步与融合蛋白A1D4混合得到疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC。DMT脂质体和A1D4/DMT疫苗经同样方法制备作为对照。3.疫苗理化性质分析:相同条件下,三次重复制备的DCBD、DCBC、A1D4/DCBD和A1D4/DCBC样品用PBS稀释10倍后动态光散射法检测粒径和多分散系数（Polydispersity index,PDI）,用PBS稀释200倍后电泳光散射法检测Zeta电位。4.动物分组及免疫:6～8周无特定病原体（Specific pathogen-free,SPF）雌性C57BL/6小鼠,随机分组:阴性对照组（PBS）、阳性对照组（卡介苗和A1D4/DMT）、佐剂对照组（DCBD或DCBC）和实验组（A1D4/DCBD或A1D4/DCBC）,每组12只。各自佐剂或疫苗组分别背部皮下注射200μL,间隔3周,免疫两次。阴性对照组每次注射等体积的PBS。卡介苗组仅皮下注射卡介苗1×10~6菌落形成单位（Colony forming units,CFU）一次。初次免疫9周或14周后,进行免疫原性分析。5.免疫原性分析:（1）脾细胞培养上清液细胞因子检测:每组各取6只小鼠,分离得到小鼠脾脏,并制备单细胞悬液。用A1D4抗原刺激后,流式微球阵列法（Cytometric bead array,CBA）检测细胞培养上清液中Th1/Th2/Th17型细胞因子水平。（2）脾脏和肺脏中抗原特异性T细胞检测:分离免疫后小鼠的脾脏和肺脏,制备脾脏和肺脏单细胞悬液。A1D4抗原刺激后,进行表面分子（CD4、CD8、CD44和CD62L）和细胞内分子（IFN-γ和IL-2）染色。流式细胞术分析小鼠脾脏和肺脏中各类T细胞的比率。（3）血清抗原特异性抗体检测:获得小鼠眼球血后,分离得到血清。酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA）检测小鼠血清中抗原特异性Ig G、Ig G2a和Ig G1抗体滴度。结果1.新型佐剂及疫苗的理化性质:DOPC和Chol在水相溶液中自组装形成囊泡状结构,可包裹卡介苗DNA、细胞壁和抗原蛋白等物质。佐剂DCBD和DCBC的粒径均在200～500 nm范围内,Zeta电位接近于中性。与佐剂DCBD和DCBC相比,加入蛋白抗原的疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC的粒径、PDI和Zeta电位均未显著改变。2.新型疫苗诱导小鼠脾脏细胞分泌的细胞因子:PBS组脾细胞培养上清液仅检测到低水平的细胞因子。阳性对照BCG和A1D4/DMT诱导产生的IFN-γ、IL-6和IL-17A水平均显著高于PBS对照。在初次免疫后9周:A1D4/DCBD疫苗诱导产生的IL-6水平显著高于佐剂DCBD对照,IL-17A水平与BCG相当;疫苗A1D4/DCBC诱导产生的IL-6水平与A1D4/DMT相当,IL-17A水平显著高于BCG。在初次免疫后14周:疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC诱导产生的IL-6水平均显著高于A1D4/DMT;疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC诱导产生的IFN-γ和IL-17A水平与BCG相当;疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC诱导产生的IFN-γ和IL-6水平均显著高于相应的佐剂对照。而且疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC诱导产生的IFN-γ水平在初次免疫后14周显著高于9周时的水平。3.新型疫苗诱导小鼠脾脏产生的T细胞反应:PBS对照组小鼠脾脏中仅检测到低水平的T细胞反应。在初次免疫后9周:各疫苗诱导小鼠脾脏产生的抗原特异性T细胞水平均显著高于PBS对照;疫苗A1D4/DCBD诱导小鼠脾脏产生的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞、IL-2+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+效应记忆T(Effector memory T,TEM)细胞水平均高于BCG,IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+TEM细胞、IL-2+CD8+T细胞和IL-2+CD8+中央记忆T(Central memory T,TCM)细胞水平与A1D4/DMT相当,IL-2+CD4+/CD8+T细胞和IL-2+CD4+TCM细胞水平显著高于佐剂DCBD对照;疫苗A1D4/DCBC诱导小鼠脾脏产生的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞、IL-2+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+TEM细胞和IL-2+CD4+TCM细胞水平均显著高于BCG和佐剂DCBC对照,IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+TEM细胞、IL-2+CD8+T细胞和IL-2+CD8+TCM细胞水平与A1D4/DMT相当。在初次免疫后14周:疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC诱导产生的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞、IL-2+CD4+/CD8+T细胞、IFN-γ+CD4+/CD8+TEM细胞和IL-2+CD4+TCM细胞水平均高于PBS对照;而且A1D4/DCBD诱导产生的IL-2+CD4+T细胞、IL-2+CD4+TCM细胞和IFN-γ+CD8+TEM细胞水平显著高于BCG。4.新型疫苗诱导小鼠肺脏产生的T细胞反应:PBS对照组小鼠肺脏中仅检测到低水平的T细胞反应。在初次免疫后9周:各疫苗诱导小鼠肺脏产生的抗原特异性T细胞反应均显著高于PBS对照;疫苗A1D4/DCBD诱导小鼠肺脏产生的IFN-γ+CD8+T/TEM细胞水平与A1D4/DMT相当,IL-2+CD4+T细胞水平显著高于佐剂DCBD对照;疫苗A1D4/DCBC诱导小鼠肺脏产生的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞、IL-2+CD4+T细胞和IFN-γ+CD4+/CD8+TEM细胞水平均显著高于BCG和佐剂DCBC对照,IFN-γ+CD4+T细胞水平和A1D4/DMT相当,且IFN-γ+CD8+T细胞和IFN-γ+CD8+TEM细胞水平显著高于A1D4/DMT。在初次免疫后14周:A1D4/DCBD、A1D4/DCBC和A1D4/DMT组小鼠肺脏中的各类T细胞水平均显著高于PBS组和BCG组;A1D4/DCBD诱导小鼠肺脏产生的IFN-γ+CD8+T细胞水平显著高于A1D4/DMT,IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞、IFN-γ+CD4+/CD8+TEM细胞、IL-2+CD4+T细胞和IL-2+CD4+TCM细胞水平均高于佐剂DCBD对照;疫苗A1D4/DCBC诱导小鼠肺脏产生的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+TEM细胞和IL-2+CD8+TCM细胞水平与A1D4/DMT相当,且IL-2+CD8+T细胞水平显著高于A1D4/DMT,IL-2+CD4+/CD8+T细胞水平显著高于佐剂DCBC对照。5.新型疫苗诱导小鼠产生的抗体反应:BCG组小鼠血清中仅检测到低水平的A1D4抗原特异性抗体。疫苗A1D4/DMT诱导产生了高水平的Ig G、Ig G2a和Ig G1抗体,随免疫后时间的延长保持稳定。在免疫后早期,疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC诱导产生的Ig G、Ig G2a和Ig G1抗体水平均高于BCG,且与A1D4/DMT相当。结论自主创新构建的佐剂DCBC和DCBD为Th1型细胞免疫反应佐剂,佐剂与A1D4抗原组成的新型结核病亚单位疫苗A1D4/DCBD和A1D4/DCBC具有良好免疫原性。本研究为进一步评价A1D4亚单位疫苗抗结核分枝杆菌感染的保护性奠定了基础。