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[目 的]1.探讨蒿甲醚逆转结直肠癌放化疗抗性的作用。2.探讨蒿甲醚逆转结直肠癌放化疗抗性的作用机制。3.探索结直肠癌放化疗抵抗细胞较亲本细胞在体内的生物学行为差别。[方 法]1.将结直肠癌放化疗抵抗细胞HCT116CRR和HT29CRR分4组处理:a.对照组;b.蒿甲醚组;c.放化疗组;d.蒿甲醚联合放化疗组。2.CCK8和克隆形成实验测各组的细胞活性和克隆形成能力。3.流式检测各组的细胞凋亡和细胞周期阻滞情况。4.Western Bolt检测各组EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail;凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2;Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin和下游靶标c-Myc,cyclinD1的表达情况。5.裸鼠右侧背部皮下注射HCT116CRR/HT29CRR细胞构建皮下移植瘤模型,待移植瘤体积长至100mm3左右,将裸鼠随机分4组处理:a.对照组;b.蒿甲醚组;c.放化疗组;d.蒿甲醚联合放化疗组。6.分组处理后每3天测量裸鼠体重,瘤体积,绘制体重、瘤体积增长曲线。治疗结束后(21天后),脱颈处死裸鼠,取出肿瘤组织,称瘤重,计算各组抑瘤率。7.流式检测各组肿瘤组织的凋亡情况。8.Western Bolt和免疫组化检测各组肿瘤组织EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail;凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2;Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin和下游靶标c-Myc,cyclinD1的表达情况。9.经裸鼠脾脏注射荧光素酶luciferase标记的结直肠癌亲本HCT116-Luc和放化疗抵抗HCT116CRR-Luc细胞构建结直肠癌肝转移模型,观测记录裸鼠饮食、体重变化,小动物活体成像观察发光强度,比较结直肠癌放化疗抵抗细胞和亲本细胞的肝转移情况。10.经裸鼠尾静脉注射荧光素酶luciferase标记的结直肠癌亲本HCT116-Luc和放化疗抵抗HCT1 16CRR-Luc细胞构建结直肠癌肺转移模型。观测记录裸鼠饮食、体重变化,小动物活体成像观察发光强度,比较结直肠癌放化疗抵抗细胞和亲本细胞的肺转移情况,处死裸鼠后计数肺转移结节数。[结 果]1.蒿甲醚体外逆转结直肠癌放化疗抗性的作用及作用机制。(1)CCK8和克隆形成结果显示,蒿甲醚能抑制结直肠癌放化疗抵抗细胞增殖,蒿甲醚与放化疗联合,能明显增强放化疗对抗性细胞的增殖抑制(/P<0.05)。(2)流式检测细胞凋亡,HCT116CRR细胞各组凋亡率分别为:对照组(1.97±0.06)%,蒿甲醚组(6.39±0.26)%,放化疗组(8.56±0.38)%,蒿甲醚+放化疗组(22.93±1.20)%;HT29CRR细胞各组的凋亡率分别为:对照组(1.92±0.09)%,蒿甲醚组(5.75±0.10)%,放化疗组(8.21±0.22)%,蒿甲醚+放化疗组(16.39±0.71)%。相较对照组,蒿甲醚组,放化疗组和蒿甲醚联合放化疗组均增加了HCT116CRR和HT29CRR细胞的凋亡率,其中蒿甲醚联合放化疗组的凋亡率最高(P<0.05)。(3)流式检测细胞周期,HCT116CRR细胞各组G2/M期的比例分别为:对照组(17.41±2.53)%;蒿甲醚组(6.53±2.61)%;放化疗组(31.09±3.50)%;蒿甲醚+放化疗组(9.71±2.34)%。HT29CRR细胞各组G2/M期的比例分别为:对照组(17.68±1.47)%;蒿甲醚组(9.35±0.78)%;放化疗组(27.88±1.93)%;蒿甲醚+放化疗组(27.88±1.93)%。对照组和放化疗组的细胞表现出较高的G2/M期阻滞,蒿甲醚组较对照组,蒿甲醚联合放化疗组较放化疗组使细胞G2/M期比例下降,逆转了 G2/M期阻滞(p<0.05)。(4)Western Bolt检测各组EMT相关蛋白结果显示,相比对照组,放化疗组间质相关蛋白N-cadherin,Vimentin和Snail表达升高;蒿甲醚组和蒿甲醚联合放化疗组上皮标志物E-cadherin表达升高,间质相关蛋白N-cadherin,Vimentin和Snail表达降低(P<0.05)。(5)Western Bolt检测凋亡相关蛋白结果显示,相比对照组,蒿甲醚组,单纯放化疗组和蒿甲醚联合放化疗组的促凋亡蛋白Bax的表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,其中蒿甲醚联合放化疗组的作用最明显(P<0.05)。(6)Western Bolt检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白结果显示,相比对照组,蒿甲醚组显著降低β-catenin,c-Myc和cycliD1的表达(P<0.05);相比放化疗组,蒿甲醚联合放化疗组同样显著抑制β-catenin,c-Myc和cyclinD1的表达(P<0.05)。2.蒿甲醚体内逆转结直肠癌放化疗抗性的作用及作用机制。(1)治疗期间各组裸鼠体重无明显差异。HCT116CRR细胞移植瘤中,各组抑瘤率分别为:蒿甲醚组:29.82%,放化疗组:52.73%,蒿甲醚联合放化疗组:76.73%;HT29CRR细胞移植瘤中,各组抑瘤率分别为:蒿甲醚组:29.92%,放化疗组:47.94%,蒿甲醚联合放化疗组:66.72%。(2)流式检测各组肿瘤组织凋亡结果与体外一致,相比于对照组,蒿甲醚组,放化疗组和蒿甲醚联合放化疗组均增加了肿瘤组织的凋亡率,其中蒿甲醚联合放化疗组的凋亡率最高(P<0.05)。(3)Western Bolt和免疫组化检测各组肿瘤组织EMT、凋亡、Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达结果与体外一致。蒿甲醚能促进E-cadherin表达,抑制N-cadherin,Vimentin和Snail表达,抑制EMT;促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,促进凋亡;抑制β-catenin,c-Myc和cycliD1的表达,失活Wnt/β-catenin通路(P<0.05)。3.两组细胞肝转移灶的发光强度分别为:HCT116-Luc(1.97±0.68)×108p/s/sr,HCT116CRR-Luc(4.17±1.11)×108 p/s/sr,(P<0.05),肺转移灶发光强度分别为:HCT116-Luc(1.85±0.29)×108 p/s/sr,HCT116CRR-Luc(2.63±0.33)×108 p/s/sr,(P<0.05)。表明结直肠癌放化疗抵抗细胞较亲本细胞在体内表现出更强的肝、肺转移能力,恶性程度更高。[结 论]1.蒿甲醚能抑制增殖,促进凋亡,逆转G2/M期阻滞,抑制EMT,逆转结直肠癌放化疗抗性。2.蒿甲醚逆转放化疗抗性的作用可能是通过失活Wnt/β-catenin信号通路实现。3.结直肠癌放化疗抵抗细胞较亲本细胞在体内具有更强肝转移、肺转移能力。