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目的氧化应激以及血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的异常增殖和迁移影响动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的形成和发展。氧化应激是刺激VSMCs异常增殖和迁移的关键影响因素,而转录因子核因子E2相关因子2（nuclearfactor E2-related factor 2,Nrf2）又是调控VSMCs细胞功能主要的抗氧化因子。然而,Nrf2调控动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞异常增殖和迁移的确切作用尚不清楚。因此,本研究旨在探讨Nrf2通路在动脉粥样硬化血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用机制。方法1.小鼠动脉粥样硬化模型建立:选取雄性C57BL/6,Nrf2-/-,Apoe-/-,Apoe-/-Nrf2-/-小鼠,从第8周开始分别给予12周的高脂饮食（high-fat diet,HFD）。2.高脂饮食结束后,对各组小鼠实施安乐死。然后分离主动脉,通过油红O染色,H＆E染色,马松染色以及免疫荧光染色的实验方法对动脉粥样硬化斑块进行组织形态学分析。3.小鼠主动脉血管平滑肌细胞动脉粥样硬化模型建立与评估:选取生长状态良好并且处于对数生长期的细胞进行铺板。贴壁24h后,更换为无血清DMEM高糖培养基,饥饿24h。然后用80mg/L的ox-LDL刺激细胞,放入细胞培养箱孵育72h,建立VSMCs动脉粥样硬化细胞模型。通过CCK-8实验方法筛选ox-LDL诱导VSMCs AS模型建立的最适浓度和最佳时间。运用细胞油红O染色以及Dil-ox-LDL荧光标记法验证ox-LDL诱导VSMCs AS模型建立是否成功。4.采用siRNA减少小鼠VSMCs上的Nrf2基因表达水平,通过构建过表达质粒过表达Nrf2基因。5.利用免疫荧光双染的实验方法将血管平滑肌细胞标志基因SMMHC或α-SMA和增殖相关蛋白PCNA,迁移相关蛋白MMP-9进行共染,从而检测血管平滑肌细胞增殖和迁移的程度。6.小鼠VSMCs增殖和迁移检测:运用CCK-8实验和EdU实验检测VSMCs增殖程度;采用Transwell小室实验分析VSMCs迁移程度。7.采用Western Blot检测小鼠血管组织和VSMCs增殖和迁移相关蛋白表达水平,4-HNE以及LOX-1的蛋白表达水平来评估血管平滑肌细胞增殖,迁移以及氧化应激情况。8.利用q-PCR实验评估Nrf2以及LOX-1的mRNA水平。9.运用ChIP-PCR,q-PCR,Western Blot实验检测转录因子Nrf2是否结合了 LOX-1的启动子序列,以及运用双荧光素酶报告实验检测转录因子Nrf2是否增强LOX-1的启动子活性。结果1.组织形态学检测C57BL/6正常饮食组,C57BL/6高脂饮食组,Apoe-/-正常饮食组和Apoe-/-高脂饮食组小鼠主动脉中斑块形成情况,结果显示Apoe-/-组小鼠斑块明显多于C57BL/6组小鼠。此外,四组小鼠血管组织Western Blot结果显示Apoe-/-正常饮食和高脂饮食组Nrf2蛋白表达水平明显增高。2.成功繁殖了 Apoe-/-Nrf2-/-小鼠,并且组织形态学染色结果显示,与Apoe-/-高脂饮食组比较,Nrf2敲除明显减轻了动脉粥样硬化程度以及斑块复杂性。3.成功构建动脉粥样硬化VSMCs细胞模型,且ox-LDL增加小鼠血管平滑肌细胞中Nrf2的蛋白和mRNA水平,诱导Nrf2核转移。4.免疫荧光双染,组织EdU实验和Western Blot检测C57BL/6,Nrf2-/-,Apoe-/-,Apoe-/-Nrf2-/-四组小鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖和迁移程度,结果显示Nrf2敲除显著降低了 Apoe-/-小鼠VSMCs的增殖和迁移程度。5.siRNA转染敲低Nrf2基因水平,细胞CCK-8实验,EdU实验以及Transwell小室实验显示Nrf2缺乏降低了 VSMCs细胞增殖和迁移数目;Western Blot检测发现,敲低Nrf2显著降低了 VSMCs增殖和迁移相关蛋白表达水平。6.血管组织α-SMA和4-HNE免疫荧光双染,以及血管组织和细胞Western Blot检测结果显示,Nrf2缺乏降低VSMCs的氧化应激水平。7.血管组织免疫荧光染色和Western Blot实验,以及细胞Western Blot和q-PCR检测结果显示,Nrf2提高了 LOX-1的活性。8.使用在线生物信息学网站NCBI,Ensemble和Jaspar预测发现转录因子Nrf2在LOX-1启动子序列上有两个结合位点。成功构建Nrf2过表达质粒;ChIP-PCR实验,q-PCR实验和Western Blot实验检测结果显示,Nrf2能够结合LOX-1启动子序列上的两个位点,同时氧化应激增加了 Nrf2与LOX-1启动子的结合,并且提高了 LOX-1的mRNA和蛋白水平。双荧光素酶报告实验结果显示Nrf2显著增强了 LOX-1的启动子活性。结论Nrf2通过转录激活LOX-1的表达从而增加ox-LDL的摄取,进而增加血管平滑肌细胞的增殖和迁移,最终促进动脉粥样硬化的形成。