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丙二酸（Malonate）是一种非常重要的二元羧酸,作为高价值化学品,常用于香精和制药等行业。当前丙二酸的生产主要依赖于化学合成法,但是化学合成的副产物较多,且存在三废处理困难等问题。因此,微生物合成丙二酸作为一种环境友好的合成方法,近年来受到了越来越多的关注。本文以酿酒酵母为研究对象,通过构建丙二酸生物合成途径、突变UAS启动子协调途径基因表达、途径基因的基因组整合与高通量筛选、丙二酸合成途径代谢改造以及发酵优化等策略,实现了丙二酸在酿酒酵母中的生物合成。主要研究结果如下:（1）启动子上游增强序列（Upstream activation sequence,UAS）文库的构建与应用。现有UAS的强度范围窄、强度弱导致了其应用局限性。为了获得具有广泛强度范围和强度增强的UAS,通过易错PCR首先构建了UASTDH3的突变文库,并利用Mi Seq高通量测序筛选了330个有效突变UAS。随后重新构建得到合成UAS文库,该文库中UAS最大强度是UASTDH3的3.65倍,最强和最弱的UAS的差异约37倍。分析突变UAS序列,发现了能增加UAS强度的15个碱基位点及对应突变碱基类型,并依此理性设计UAS文库。为了预测理性设计UAS的强度,确定了UAS碱基序列与其强度之间的线性关系,并根据UAS的DNA曲率与其强度建立了预测模型。为后续代谢途径的调控,建立了转录调控的工具。（2）构建了经由β-丙氨酸的丙二酸生物合成途径。通过基因组整合外源基因Bc BAPAT和Tc PAND以及过表达酿酒酵母内源基因AAT2和UGA2,成功在酿酒酵母中构建了合成丙二酸的β-丙氨酸途径,丙二酸产量为7.21 mg/L。将琥珀酸半醛脱氢酶更换为yneI,构建了丙二酸生产菌株BA-5,丙二酸产量提高至7.96 mg/L。BA-5菌株经过补加碳源的方式优化,5-L发酵罐补料分批发酵时丙二酸产量达到91.53 mg/L。（3）构建了经由丙二酰-CoA的丙二酸生物合成途径。为了构建丙二酰-CoA途径,对内源3-羟基异丁酰-CoA水解酶编码基因EHD3进行了线粒体定位序列、活性位点F121和E124的突变,获得了定位于细胞质并具有丙二酰-CoA水解酶活性的EHD3***突变基因。同时过表达突变磷酸化位点的乙酰-CoA羧化酶编码基因ACC1**,最终构建得到在突变UAS启动子PUAS1和PUAS2的控制下经质粒游离表达EHD3***和ACC1**的丙二酸生产菌株LMA-S,其摇瓶发酵条件下该菌株丙二酸产量达到13.6 mg/L,高于相同条件下β-丙氨酸途径优化后的产量。（4）优化了丙二酰-CoA途径关键基因的表达以及前体乙酰-CoA的供应。为了稳定基因的表达和提高表达水平,设计了基于delta序列的多拷贝基因组整合方案,在整合目的基因ACC1**和EHD3***的同时整合绿色荧光蛋白基因GFP作为拷贝数筛选标记,建立了基于荧光强度的高通量筛选方法。通过试管发酵和摇瓶发酵逐渐扩大的发酵过程最终筛选出高拷贝整合菌株LMA-1,该菌株丙二酸产量为73.55 mg/L,与游离质粒表达菌株LMA-S相比,丙二酸产量提高了约5倍。为了减少胞质乙酰-CoA向其它竞争途径的消耗和增加胞质乙酰-CoA的积累,进一步优化了乙酰-CoA代谢途径相关基因的表达。结果表明过表达PDC1基因和敲除MLS1基因的菌株LMA-12可最大程度的提高丙二酸产量,最终丙二酸产量提高至100.59 mg/L。（5）丙二酰-CoA途径整合菌株的发酵优化。通过在发酵12 h和24 h补加5 g/L葡萄糖使LMA-12菌株的丙二酸产量提高至145 mg/L,与优化前相比提高了45%。通过进一步优化外源添加金属离子的浓度和种类,确定外源添加200 mM MgCl2对丙二酸产量提高最明显,且Mg2+能够显著提高PDC1的表达水平。将PDC1启动子替换为Mg2+响应启动子PPCK1获得LMA-16菌株,结合外源添加200 mM MgCl2和碳源的发酵策略,LMA-16菌株丙二酸产量最终提高至187.25 mg/L,与LMA-12菌株相比,提高了23%。最后,采用缓慢流加氮源和葡萄糖的补料分批发酵策略进行5-L发酵罐水平的发酵优化,丙二酸产量提高至1.626 g/L。