日本乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE),是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。该病可以感染人和多种脊椎动物,并可造成不可逆的神经损害,具有重要的公共卫生意义。病毒传播给人类时,猪是最主要的病毒增殖宿主。感染乙脑的妊娠母猪出现流产、产下死胎或木乃伊胎,公猪则出现睾丸炎,给养殖业造成了巨大的经济损失。反向遗传系统对于病毒研究来说是强大的工具。然而日本乙型脑炎病毒基因组在宿主大肠杆菌体内并不稳定,序列时常自发突变、重组、插入或缺失。不稳定性可能源于病毒cDNA编码产物的意外表达对细菌产生毒害作用,这大大增加了构建日本乙型脑炎病毒反向遗传系统的难度。本研究的目标是构建日本乙型脑炎病毒反向遗传系统。由于病毒基因组在宿主体内的不稳定性,乙脑病毒SA14-14-2疫苗株的基因组被分别克隆至两个不同的载体上。首先通过PCR方法扩增出乙脑病毒基因组5’非编码区及结构蛋白区(1~2590位核苷酸)片段并克隆到载体pJET 1.2上,获得载体pJET-NS。与此同时,在PCR过程引入突变90A>C、101T>G、104A>G、107A>G、1355T>C,1385A>G以降低乙脑基因组中隐藏大肠杆菌启动子活性,增加病毒基因组稳定性。已构建完成的转移载体pSh-JEV-In-EGFP中含有乙脑复制子结构,因此可以通过酶切连接的方法把乙脑病毒基因组的非结构蛋白区及3’非编码区(2591~10977位核苷酸)克隆到低拷贝质粒pOK12上,获得pOK12-JEV-In-EGFP。接着使用融合PCR把分散在两个载体中乙脑基因组进行组装,在组装的过程中乙脑基因组5’端上游添加了T7启动子。得到全长cDNA后,体外转录合成具有感染性的乙脑基因组RNA。病毒RNA以电穿孔法转染至BHK-21细胞,在BHK-21细胞上传代,用ICC法和RT-PCR方法进行鉴定,最后获得具有感染性的改造病毒SA14-14-2。本研究成功构建了日本乙型脑炎病毒的反向遗传系统,为进一步探索JEV的各个蛋白功能和致病机制打下了基础,也为构建全长感染性克隆做好充分准备。