马铃薯StPHT4;2磷转运蛋白基因的克隆及功能研究

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在中国马铃薯(Solanum tuberosum L.)是仅次于小麦、玉米和水稻的第四大粮食作物。植物磷酸盐转运蛋白PHT(Phosphate transporter)是介导植物体内各类磷酸盐转运的载体蛋白,对于植物的生长和发育至关重要。PHT蛋白属于MFS(Major Facility Superfamily)主要促进者超家族中的PHS(Phosphate:H+Symporters)磷酸盐家族。迄今为止人们对植物PHT4亚家族的研究相对较少,PHT4;2属于PHT4亚家族中的一员。经前人研究PHT4;2基因主要在质体中扮演一定地角色,关于马铃薯中StPHT4;2基因功能的研究目前尚未见报道。本研究利用生物信息学的方法对马铃薯StPHT4亚家族成员的基因结构、蛋白质结构特性和在马铃薯中的相对表达模式进行了研究分析,构建了马铃薯、水稻、苹果、高粱和拟南芥PHT4家族成员的系统发育进化树。使用基因工程的方法构建了StPHT4;2基因的沉默表达载体和过表达载体,通过农杆菌介导地遗传转化将StPHT4;2基因的沉默表达载体和过表达载体转化马铃薯品种“Desiree”得到转基因马铃薯。还构建了StPHT4;2基因的GFP载体并分析了 StPHT4;2的亚细胞定位。对所得到地3个StPHT4;2过表达株系和4个StPHT4;2沉默表达株系进行0、0.25、0.50、1.00 mM/L磷梯度水培处理和盆栽种植,对其株高、根长、叶面积、叶绿素含量、SPAD值、根茎叶磷含量、块茎类胡萝卜素和调控类胡萝卜素合成相关基因的表达量等进行测定,初步探究了StPHT4;2基因在马铃薯生长发育过程中的生物学功能。其主要研究结果如下:(1)通过生物信息学分析,在马铃薯基因组中共鉴定到5个StPHT4亚家族成员,它们含有4~7个不等的微孔转运通道(Poree-lining)。系统发育进化树表明,5个物种中的PHT4亚家族成员可以粗略分为3个亚群。其中StPHT4;1和StPHT4;3被分为第Ⅰ亚群,StPHT4;2、StPHT4;4和StPHT4;5被分为第Ⅱ亚群。(2)基于基因表达模式热图初步分析发现StPHT4;2基因除了行使其本身的磷转运载体功能之外可能还参与类胡萝卜素与ABA的代谢,这可能会影响马铃薯对热、干旱等非生物胁迫的耐受性。(3)成功构建了StPHT4;2-GFP表达载体,通过亚细胞定位推测StPHT4;2表达于细胞膜和质体膜上。(4)为了研究StPHT4;2基因在马铃薯中的生物学功能,成功构建了马铃薯StPHT4;2的过表达载体StPHT4;2-pBI121和沉默表达载体StPHT4;2-pBIN19,并成功将其遗传转化至马铃薯品种“Desiree”,通过抗性培养基筛选、PCR和qRT-PCR等检测方法成功获得阳性转基因植株。(5)通过磷梯度水培处理试验和盆栽培育转基因马铃薯TO代组培苗,发现低磷处理下StPHT4;2沉默表达株系的根长和株高均高于StPHT4;2过表达株系,但是各组织中磷含量较StPHT4;2过表达株系低。StPHT4;2沉默表达株系的电导率高于对照和StPHT4;2过表达株系。沉默表达StPHT4;2基因能增加马铃薯叶片中的叶绿素含量。StPHT4;2基因过表达的株系叶面积会大幅增加。StPHT4;2过表达株系的块茎产量普遍高于StPHT4;2沉默表达株系。StPHT4;2沉默表达株系块茎中的类胡萝卜素含量会明显下降,但是过表达株系较对照没有明显升高。StPHT4;2沉默表达株系块茎中ZDS表达量下调,StPHT4;2基因过表达株系中ZDS表达量上调,这可能是造成各株系块茎中类胡萝卜素含量差异的原因之一。
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