喜树内生真菌的分离及其代谢产物10-羟基喜树碱的研究

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本文以我国特有药用植物喜树(Camptotheca acuminate Decne)为实验材料,对喜树内生真菌的组织分布及分离方法进行研究。实验结果表明,材料的表面消毒以75%乙醇和0.1%升汞结合的方法较好。对喜树的根部和茎部的升汞消毒时间以4~5min为宜,喜树叶子的升汞消毒时间应控制在2min左右。在所试条件下共计分离得到38株内生真菌,主要分布在树叶(39.3%)和皮部(37.1%),根部(15.9%)和种子(7.7%)中的内生真菌数目较少,在木质部未分离到内生真菌。本文对10-羟基喜树碱的薄层层析TLC条件及高效液相色谱HPLC检测条件进行了探讨,确定了适合10-羟基喜树碱的展开剂为氯仿/甲醇(体积比9/1);测定10-羟基喜树碱的HPLC条件为:色谱柱:Phenomenex C18柱(250mmx 4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水(20:80);柱温:30℃;检测波长:266nm;流速:0.8mL/min。2株内生真菌A5、A9的发酵产物中检出10-羟基喜树碱。利用传统分类学方法和ITS序列的测定以及系统发育分析对A5、A9进行分类鉴定,鉴定结果表明A5为Botryosphaeria berengeriana:A9为Diaporthephaseolorum。对菌株A9的发酵条件和培养基组成进行了初步优化,优化培养基组成为:2%葡萄糖、2.6%黄豆饼粉、0.3%磷酸二氢钾、0.3%的七水硫酸镁。最佳摇瓶培养条件为:培养基起始pH6.0,摇床转速220r/min,培养温度28℃,培养6天。在上述条件下,10-羟基喜树碱的产量为80礸/L,与出发菌株相比产量约提高了23%。
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