阿维拉霉素高产菌的推理选育及其制备

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阿维拉霉素是一种奥尔托索霉素族的混合型寡糖类的抗生素,具有抗菌促生长的作用,能够维持动物肠道内细菌的正常平衡,以其高安全性、低毒性以及低残留被广泛的作为兽用饲料添加剂使用。本论文通过诱变育种方法,结合阿维拉霉素、利福平及2-脱氧-D-葡萄糖等抗性因子,选育了高产阿维拉霉素的突变株并研究了其代谢特征。rpoB基因序列分析阐述了利福平抗性与突变株阿维拉霉素产量之间的关系;同时建立了从菌丝体中提取、分离纯化阿维拉霉素较纯品的方法。以实验室保存的S.viridochromogene 1315为出发菌株,经过两轮诱变及抗性筛选,初步筛选出6株优势菌,其中菌株Y116-29的摇瓶发酵产量达到了 364.12mg/L,是出发菌株S-1315的3.25倍;菌株Y117-67的摇瓶发酵产量达到了358.64 mg/L,是原始菌株S-1315的3.2倍。突变菌株与原始菌株的生长代谢情况大体一致,但其阿维拉霉素的合成期时间增长。在前期快速生长主要进行碳源及氮源的能量消耗,阿维拉霉素几乎不合成;阿维拉霉素产物主要在菌体生长后期进行积累。由此可推测阿维拉霉素代谢产物的积累可能在菌丝生长停滞期及凋亡延滞前期。对出发菌株、优势菌株的rpoB基因进行比对分析,结果显示本实验室的菌株有22个氨基酸序列与数据库报导的Streptomyces viridochromogenes DSM 40736(GenBank:NZGG657757.1)菌株存在差异,推测阿维拉霉素产量变化、菌株形态分化与此基因突变有一定的关联性。高产突变株的rpoB氨基酸序列有2个位点发生了突变,即G1108D,F1121S,这一突变是否与利福平耐药性相关还有待研究。采用甲醇、丙酮等有机试剂在37℃下提取菌丝体,然后低温重结晶,得到阿维拉霉素粗品。利用正向硅胶柱色谱、TLC、分析型HPLC对粗品进行分离纯化,获得较高纯度的阿维拉霉素;利用液质联用、红外及核磁对目标化合物进行分子量及化学结构的验证。最终得到的阿维拉霉素A和B含量达到了 96.47%。
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