研究背景胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤之一,其总体5年生存率不足8%。近年来,随着研究的深入,越来越多的治疗方案被不断提出,但胰腺癌患者的预后并未得到明显的改善。目前,传统的化疗药物对胰腺癌患者疗效有限,胰腺癌的靶向治疗也一直举步维艰。2005年FDA批准了“吉西他滨+厄洛替尼”用于局部晚期不可切除或有远处转移的胰腺癌患者的治疗,然而仅约10天的生存期提高使得厄洛替尼在胰腺癌治疗中难以取得较大的临床获益。2019年12月,FDA批准了 PARP抑制剂奥拉帕利用于携带BRCA基因突变的转移性胰腺癌患者的维持治疗,然而携带有BRCA基因突变的转移性胰腺癌患者人群数量有限。因此,有必要继续探索新的抗胰腺癌靶点,为未来胰腺癌的临床治疗研究提供一定的基础。细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)在细胞周期的调控中处于核心地位。目前,在人体中已发现的CDKs包含20个亚型,其中CDK1～6和CDK14～18直接参与细胞周期调控,其它CDKs则主要调控基因转录。已有研究证实,CDKs的异常激活可导致细胞周期进程的失调,从而导致肿瘤细胞异常增殖。近年来,已有多个CDK4/6的选择性小分子抑制剂被FDA批准上市,用于晚期或转移性乳腺癌患者。有研究发现了 CDKs在胰腺癌的发生和发展中具有重要作用。CDK5在胰腺腺癌中过度表达,可促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。KRAS突变可刺激CDK8的表达,通过Wnt/β-catenin信号通路促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移。在众多的CDKs中,CDK1则具有不可替代的位置。在正常生理条件下,CDK1与Cyclin A或Cyclin B形成复合物,调控细胞周期G2/M,而CDK1异常激活则与肿瘤的发生发展密切相关。CDK1在结直肠癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤中过表达,并且与患者的不良预后有关。CDK1选择性抑制剂RO3306对白血病、乳腺癌等多种肿瘤细胞具有良好的抗增殖活性。然而CDK1在胰腺癌中的研究仍然较少。有研究发现,磷酸酶CDC25B的抑制剂可抑制胰腺癌细胞生长,并观察到CDK1磷酸化水平增高以及细胞G2/M期阻滞。CDK1在胰腺癌患者组织中高表达,且与患者较差的预后有关。目前仍未有研究阐明抑制CDK1对胰腺癌生长的影响,CDK1在胰腺癌中的生物学功能与临床意义有待进一步探索。此外,尽管已有研究发现CDKs泛抑制剂具有良好的抗胰腺癌活性,然而靶向CDK1的选择性抑制剂RO3306在胰腺癌中的抗肿瘤活性及作用机制尚未见报道。因此,仍需进一步研究CDK1成为抗胰腺癌靶点的潜力,探索新的抗胰腺癌策略。另一方面,细胞凋亡的异常调控也是胰腺癌发生发展的重要原因。有研究表明,抗凋亡蛋白Mcl-1在胰腺癌中异常表达,抑制Mcl-1可抑制胰腺癌的生长。对Mcl-1蛋白及内源性细胞凋亡通路的调控是CDKs抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的重要机制。因此,可通过研究CDK1抑制剂RO3306对Mcl-1蛋白的影响,进而分析其作用机制。另外,多项研究表明,Mcl-1小分子抑制剂具有较好的抗胰腺癌活性。因此,进一步筛选新型Mcl-1抑制剂有助于将来探索新的抗胰腺癌策略。研究目的本课题旨在研究CDK1作为新型抗胰腺癌靶点的潜力,探索新的抗胰腺癌策略,为将来胰腺癌的临床转化研究提供一定的基础。首先,研究CDK1在胰腺癌中的生物学功能;其次,研究CDK1在胰腺癌患者中的表达及临床意义;再次,进一步对已知的CDK1抑制剂RO3306进行抗胰腺癌活性研究,通过研究RO3306对Mcl-1等相关蛋白的影响以探索其作用机制;最后,筛选新型CDK1抑制剂和Mcl-1抑制剂,并对其进行靶点抑制活性及抗胰腺癌活性研究。研究方法和结果第一部分敲减CDK1对胰腺癌体内外生长的影响1、首先,通过生物信息学分析、基因敲减和细胞增殖实验,发现敲减CDK1能够在体外显著抑制胰腺癌细胞的增殖。(1)基于TCGA数据中170余例胰腺癌患者的mRNA表达谱数据,通过生物学信息学GEPIA平台分析了CDK1-CDK10在胰腺癌组织和正常组织中的表达情况,发现CDK1、CDK2和CDK6在胰腺癌患者组织中高表达(p<0.01),且其高表达与患者差的生存期相关(p<0.05)。(2)通过Celigo细胞增殖实验,分别研究了敲减CDK1、CDK2和CDK6对Panc-1胰腺癌细胞增殖的影响,发现敲减CDK1对Panc-1细胞增殖的抑制效果最为明显(p<0.005)。2、进一步研究了敲减CDK1对胰腺癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移的作用。通过MTT细胞增殖实验,发现了敲减CDK1可抑制胰腺癌细胞(Panc-1和Aspc-1)的增殖(p<0.05)。使用流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡实验,结果表明,敲减CDK1可将胰腺癌细胞(Panc-1和Aspc-1)阻滞在G2/M期(p<0.05),但对细胞凋亡无明显影响(p>0.05)。通过Transwell实验表明,敲减CDK1能够抑制Panc-1细胞迁移(p<0.05),而对Aspc-1细胞的迁移没有影响(p>0.05)。3、使用肿瘤异种移植模型研究了敲减CDK1对裸鼠胰腺癌体内生长的影响,结果表明,与对照组相比,敲减CDK1的瘤体生长速度及重量均低于对照组(p<0.05)。第二部分CDK1在胰腺癌患者中的表达与临床意义1、首先,通过免疫组化方法检测了 CDK1在90例胰腺癌术后患者的胰腺癌组织及对应的60例癌旁组织中的表达。结果显示,在44例有配对癌旁组织的患者中,CDK1在胰腺癌患者中高表达,其细胞浆表达高于细胞核表达(p<0.05)。2、进一步分析了 73例胰腺癌患者中CDK1的表达与临床病理特点的关系。结果示,CDK1在细胞浆中的表达与组织学分级、p53和Ki67表达有关(p<0.05);CDK1在细胞核中的表达与p53表达有关(p<0.05)。3、最后,分析了 CDK1的表达与73例胰腺癌患者预后的关系。Kaplan-Meier曲线法及单因素分析表明,CDK1细胞浆高表达的患者具有更短的总生存期(p<0.05)。COX多因素分析表明组织学分级和N分期是总生存期的独立预后因子(p<0.05),而CDK1不是总生存期的独立预后因子(p>0.05)。CDK1细胞核表达与胰腺癌患者的总生存期无关(p>0.05)。第三部分CDK1抑制剂RO3306的抗胰腺癌活性及作用机制研究1、首先,研究了 RO3306在胰腺癌细胞中的抗增殖活性。(1通过Western-blot实验,检测了 CDK1在五种胰腺癌细胞系中的表达,发现了 CDK1在SW1990细胞系中表达量最高。(2)通过SRB细胞增殖实验,发现了 RO3306能够抑制五种胰腺癌细胞的增殖,且其对SW1990细胞的抗增殖效果最佳(IC50=2.9 μM),优于化疗药物5-Fu(IC50=4.9 μM)。2、进一步研究了 RO3306抗胰腺癌的作用机制。(1)使用流式细胞仪检测了 RO3306对SW1990细胞周期的影响,结果发现,RO3306能够将细胞周期阻滞在G2/M和S期(p<0.05)。通过Western-blot实验表明,RO3306可能是通过激活p53-p21信号通路实现对细胞周期S期的阻滞。(2)使用流式细胞仪检测了RO3306对SW1990细胞凋亡的影响,结果发现,RO3306能够诱导SW1990细胞凋亡(p<0.005)。通过Western-blot实验表明,RO3306可能通过影响Bcl-2-Bax信号通路以及调控Mcl-1蛋白的磷酸化水平,进而诱导胰腺癌细胞凋亡。3、最后,通过SRB抗增殖实验研究了 RO3306与四种化疗药物(5-Fu、吉西他滨、紫杉醇或奥沙利铂)的联合用药效果,结果表明RO3306能够增强5-Fu和紫杉醇对胰腺癌细胞SW1990的抗增殖活性。第四部分新型CDK1抑制剂及Mcl-1抑制剂的研究1、通过计算机虚拟筛选平台进行了 CDK1抑制剂以及Mcl-1抑制剂的筛选。综合运用三维药效团和分子对接技术,分别构建了针对CDK1小分子抑制剂和Mcl-1小分子抑制剂的虚拟筛选平台,对商业化合物库中21万个分子进行了虚拟筛选。通过对筛选到的命中化合物进行活性测试,发现了初步具有CDK1抑制活性的化合物,以及与阳性药Gossypol活性相当的Mcl-1抑制剂M02(Ki=5.4μM)和 M08(Ki=0.53μM)。2、进一步研究了新型Mcl-1抑制剂M02和M08的抗胰腺癌活性。Western-blot实验表明,Mcl-1蛋白在五种胰腺癌细胞中均有表达,在SW1990细胞中表达最高。SRB实验表明,M02和M08在胰腺腺癌细胞SW1990中具有一定的抗增殖活性(IC 50=44.4-48.4μM)。细胞周期和细胞凋亡实验表明,M02和M08不仅能够诱导SW1990细胞凋亡(p<0.005),而且可将细胞周期阻滞在G2/M期(p<0.05)。进一步的联合用药实验表明,M08能够提高吉西他滨或5-Fu对胰腺癌细胞的抗增殖活性,而M02对吉西他滨或5-Fu的抗增殖活性影响较小。研究结论1、敲减CDK1对胰腺癌细胞具有抗增殖活性,可将胰腺癌细胞阻滞在G2/M期,并且在小鼠肿瘤异种移植模型中具有较好的肿瘤生长抑制效果,表明CDK1有望成为新型抗胰腺癌靶点。2、CDK1在胰腺癌患者中高表达,其细胞浆表达高于细胞核表达。细胞浆表达与肿瘤级别、p53表达和Ki67表达等临床病理特征有关,细胞核表达与p53的表达有关。细胞浆高表达CDK1的患者具有更短的总生存期。提示CDK1可作为胰腺癌潜在的生物学标志物。3、CDK1抑制剂RO3306在多种胰腺癌细胞系中均具有抗增殖活性。RO3306对胰腺癌细胞周期阻滞的作用与p53-p21信号通路有关。RO3306还可通过影响Bcl-2-Bax信号通路以及下调Mcl-1蛋白的磷酸化水平,进而诱导胰腺癌细胞凋亡。此外,RO3306能够增强5-Fu或紫杉醇对胰腺癌细胞的抗增殖活性。4、发现了新型具有CDK1抑制活性的化合物,以及与阳性药活性相当的Mcl-1新型抑制剂M02和M08。特别是,M02和M08具有抗胰腺癌活性,且M08可增强吉西他滨或5-Fu对胰腺癌细胞的抗增殖活性。