【摘 要】
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凝集素特异性识别糖的能力使其被广泛应用于糖基化研究,而在运用凝集素研究糖基化技术中,广泛应用到生物素-亲和素系统（Biotin-Avidin—System,BAS）。该系统的原理是先将待测糖蛋白与生物素化的凝集素孵育,然后与亲和素-酶偶联物孵育,最后用底物检测与亲和素结合的酶,通过底物信号间接实现对糖蛋白的分析。但该系统存在步骤繁琐、成本较高、反应层次较多影响其特异性等缺点。因此,本研究制备了一种
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凝集素特异性识别糖的能力使其被广泛应用于糖基化研究,而在运用凝集素研究糖基化技术中,广泛应用到生物素-亲和素系统（Biotin-Avidin—System,BAS）。该系统的原理是先将待测糖蛋白与生物素化的凝集素孵育,然后与亲和素-酶偶联物孵育,最后用底物检测与亲和素结合的酶,通过底物信号间接实现对糖蛋白的分析。但该系统存在步骤繁琐、成本较高、反应层次较多影响其特异性等缺点。因此,本研究制备了一种凝集素与荧光融合蛋白,通过凝集素所连接荧光蛋白的荧光信号直接检测糖蛋白,极大简化实验步骤、降低生产成本,降低反应层次,提高其特异性。本研究克隆得到柞蚕凝集素Ap MBL c DNA序列并进行生物信息学分析,结果表明:Ap MBL蛋白编码327个氨基酸,前23位为其信号肽区域,预测其分子量为37.5KDa,等电点为5.47,Ap MBL蛋白与VIP36蛋白同源性较高,含有一个L型凝集素结构域以及一个跨膜区,β-折叠（extended strand）与无规则卷曲（random coil）是其主要二级结构原件;将凝集素Ap MBL与EGFP通过Linker序列拼接起来形成融合片段Ap MBL-EGFP,生物信息学分析检测其设计合理性,结果表明:Ap MBL-EGFP融合蛋白分子量为67KDa,等电点为6.41,Linker序列的添加使得Ap MBL蛋白与EGFP蛋白结构和功能互不影响,且有较强亲水性。利用融合PCR将Ap MBL与EGFP两个片段连接,并连接至p ET-28（a+）表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达,再通过融合蛋白N端His标签,用镍柱亲和层析纯化Ap MBL-EGFP融合蛋白,经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色及Western blot检测分析,结果发现:在大肠杆菌表达系统中成功表达且纯化得到Ap MBL-EGFP融合蛋白。通过荧光光谱分析、凝集细菌实验以及酶联免疫吸附测定实验（ELISA）分别检测Ap MBL-EGFP融合蛋白荧光活性、凝集活性以及糖结合活性,结果表明:Ap MBL-EGFP融合蛋白具有与EGFP趋势一致的荧光光谱,对肠沙门氏菌、大肠杆菌以及甲基营养型芽胞杆菌3种细菌凝集活性较高,与脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖以及麦芽三糖具有一定结合活性,且呈现浓度依赖性;最后使用纯化得到的Ap MBL-EGFP融合蛋白应用于糖蛋白斑点免疫印迹分析,结果表明:在斑点印迹分析中,应用该蛋白能够有效检测糖蛋白,且与生物素-亲和素系统相比,具有实验步骤简便、生产成本低、且不需额外显色试剂等优点,在凝集素免疫分析中具有巨大的潜力。
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