异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,IDH）是三羧酸（tricarboxylic acid,TCA）循环的一个关键酶,控制着TCA循环和乙醛酸旁路（glyoxylate cycle）中碳流的分布。异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase,ICL）是乙醛酸旁路的一个重要的酶,通常与NADP-IDH共存。大部分细菌基因组只编码一种IDH,小部分细菌基因组同时编码两种不同类型的IDH,且对后者的研究非常少。苛养木杆菌（Xylella fastidiosa）是营养苛刻的植物致病菌,同时含有两种结构不同的IDH,一种是NAD⁺依赖型的同源二聚体IDH（diXfIDH）,另一种是NADP⁺依赖型的单体IDH（monoXfIDH）。尽管该菌有一个NADP-IDH,但是它的基因组没有编码ICL的基因。因此,对这两种不同类型IDH生化特性的研究是非常有意义的。在本研究中,我们对野生型diXfIDH和monoXfIDH以及构建的5个突变体酶进行了异源表达、纯化和酶学性质的研究。SDS-PAGE结果分析显示,diXfIDH亚基分子量在38 kDa附近,monoXfIDH的分子量大约81 kDa,这与在线软件预测的结果一致。通过凝胶排阻色谱进一步测定蛋白diXfIDH和monoXfIDH的分子量分别为59 kDa和76 kDa,分别小于其理论值76 kDa和82 kDa。这可能是由于diXfIDH的两个亚基包裹得更为紧密或者是层析柱对两个蛋白有一定的吸附作用,才使得凝胶排阻色谱测得的值比理论值偏小。针对此现象,我们又做了MALDI-TOF/TOF质谱分析。质谱结果准确地显示,diXfIDH和monoXfIDH的分子量分别为75.5 kDa和82.4 kDa,与理论值基本一致。圆二色谱分析结果显示,突变体酶与相应野生型酶的二级结构十分相似,几个氨基酸的替换没有引起蛋白质二级结构的改变。动力学参数研究显示,diXfIDH对NAD⁺的偏好性是其对NADP⁺的206倍,而monoXfIDH对NADP⁺的偏好性是其对NAD⁺的13785倍。diXfIDH在pH 8.0到9.0的区段有最大活性,而monoXfIDH最适pH则是7.75。diXfIDH和monoXfIDH的最适温度分别是55°C和50°C。热稳定性研究显示,温度低于40°C,diXfIDH比较稳定,但是蛋白在47°C下孵浴20 min后,其活性丧失50%。然而,与diXfIDH相比,monoXfIDH的热稳定性较差。温度低于35°C,monoXfIDH相对比较稳定,高于35°C时,蛋白迅速失活,当温度达到42.5°C时,蛋白几乎完全失活。diXfIDH和monoXfIDH的最适金属离子分别是Mg²⁺和Mn²⁺。Zn²⁺和Cu²⁺是diXfIDH的强抑制剂,Zn²⁺则是monoXfIDH的强抑制剂。通过定点突变技术,研究diXfIDH(D²⁶⁸,I²⁶⁹和A²⁷⁵)和monoXfIDH(K⁵⁸⁹,H⁵⁹⁰和R⁶⁰¹)的辅酶结合位点。diXfIDH的三个突变体酶D268K、D268K/I269Y和D268K/I269Y/A275V对NADP⁺的偏好性分别是其对NAD⁺的3、40和62倍,表明三个突变体酶都实现了辅酶特异性由NAD⁺向NADP⁺的转变。与野生型monoXfIDH相比,它的2个突变体酶H590L/R601L和K589T/H590L/R601L对NADP⁺的亲和性分别降低了1506倍和959倍,但这两个突变体酶对NAD⁺的催化能力未能大幅度提升,它们成为可以使用2种辅酶的IDH。本文对苛养木杆菌的两种IDH进行了详细的酶学鉴定。diXfIDH和monoXfIDH都是高催化效率的酶,其中monoXfIDH的活性是迄今发现的活性最高的酶。由于在苛养木杆菌中,NADP-IDH与ICL不共存,因此关于monoXfIDH的研究有助于对NADP-IDH、ICL、乙醛酸旁路三者之间关系的深入探讨。