论文部分内容阅读
目的:本实验拟将兔脂肪来源的血管基质成分(SVF)混合兔耳颗粒软骨自体异位移植,观察移植体的组织结构、血管数、生长因子等指标。探究SVF对颗粒软骨血管新生的影响。方法:首先,手术切开获取24只新西兰大兔双侧腹股沟脂肪组织,利用酶消化法分离提取出血管基质成分(SVF)。保留部分新鲜提取的SVF备用。以流式细胞技术鉴定血管基质成分中的脂肪干细胞和内皮细胞;然后,切取新西兰大兔单侧耳软骨,制成约1.0mm~3颗粒软骨。设计对照组(颗粒软骨+完全培养基)和实验组(颗粒软骨+SVF)。两组复合移植体以注射法分别植入大兔两侧背部皮下并标记后正常饲养;最后,分别于术后4周、12周、24周随机处死大兔并取样,观察颗粒软骨再生成型大体标本情况,并进行湿重对比;组织学染色观察软骨细胞活性及微血管生长情况;免疫组化观察血管内皮细胞标记物CD31;荧光定量PCR检测在移植体中HIF-1α、VEGFmRNA水平;蛋白免疫印迹(WB)检测移植体中HIF-1α、VEGF表达情况。结果:P0代SVFs进行流式细胞检测中:加入CD90和CD73为阳性标记物同时以CD45和CD31为阴性标记物,CD90和CD73均高表达,CD45和CD31均低表达;加入CD34和CD31阳性标记物,CD34和CD31高表达。提示SVFs中含有脂肪干细胞(ADSCs)和内皮细胞(EC);颗粒软骨移植体湿重检测结果示:对照组4周、12周、24周移植体湿重分别为(2.080±0.224)g、(1.990±0.205)g、(1.995±0.192)g;实验组4周、12周、24周移植体湿重分别为(2.141±0.257)g、(2.215±0.203)g、(2.210±0.205)g。其中4周时两组间湿重差异无统计学意义(P>0.05)。而12、24周实验组重量显著高于对照组(P<0.05)。各对照组重量较术前未有明显改变(P>0.05)。4周实验组较术前重量差异无统计学意义(P>0.05);HE染色显示:对照组:在倒置显微镜下4周颗粒软骨移植体可见少量新生软骨细胞,中央区可见少量软骨凋亡及炎性反应,未见明显血管长入。12周及24周时可见软骨少量增生,软骨细胞层数较实验组少,血管分布较少;实验组:在倒置显微镜下4周软骨细胞增生较活跃,软骨细胞层数较对照组多,可见少量炎性细胞,软骨周边可见少量血管形成。12周、24周可观察到大量新生软骨细胞,体积逐渐增大,炎性细胞减少,可见较多新生血管;CD31组织免疫组化示:术后4、12、24周对照组微血管数明显低于实验组:[(35.27±1.95)/(55.42±2.15)、(41.80±2.51)/(67.32±2.21)、(57.55±1.89)/(71.12±1.87)](均P<0.05)。最后,根据检测RT-PCR及WB对HIF-1α、VEGFmRNA水平和产物表达水平的检测:根据检测RT-PCR检测,可见实验组VEGF及HIF-1α的mRNA的表达均提高。术后12周开始略有降低,术后24周其mRNA水平仍高于对照组水平;(P均<0.05);根据WB检测,实验组术后4、12、24周VEGF、HIF-1α相对表达水平较对照组均增高(P<0.05)。结论:1.自体脂肪组织血管基质成分复合颗粒软骨注射移植,可以促进颗粒软骨血管新生;2.血管基质成分可提高复合移植体的VEGF及HIF-1α的表达水平,这可能是血管基质成分促进颗粒软骨血管新生的部分机制;