【摘 要】
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目的:(1)通过小鼠转移前微环境模型,选取不同时间点的网膜组织,利用RNA-seq方法筛选与卵巢癌转移前微环境相关的差异基因;(2)对卵巢癌组织中胶原三股螺旋蛋白1(CTHRC1)与M2型巨噬细胞浸润密度进行临床资料的相关性分析;(3)从细胞学水平上验证CTHRC1促进肿瘤相关巨噬细胞极化的机制及其对卵巢癌生物学行为的影响。方法:(1)应用C57BL/6雌鼠卵巢癌细胞ID8细胞,慢病毒稳定转染td
【基金项目】
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国家自然基金委面上项目(81672564);
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目的:(1)通过小鼠转移前微环境模型,选取不同时间点的网膜组织,利用RNA-seq方法筛选与卵巢癌转移前微环境相关的差异基因;(2)对卵巢癌组织中胶原三股螺旋蛋白1(CTHRC1)与M2型巨噬细胞浸润密度进行临床资料的相关性分析;(3)从细胞学水平上验证CTHRC1促进肿瘤相关巨噬细胞极化的机制及其对卵巢癌生物学行为的影响。方法:(1)应用C57BL/6雌鼠卵巢癌细胞ID8细胞,慢病毒稳定转染tdtomato/luciferas,C57BL/6雌鼠腹腔内注射,注射后分别选取24小时、3天、10天和21天进行小动物活体成像,将24小时组的小鼠处死,解剖网膜组织,DAPI染色,共聚焦显微镜成像;解剖对照组、24小时组、3天组、21天组网膜组织,固定石蜡包埋,HE染色,显微镜下观察;(2)对不同时间点的小鼠网膜组织进行RNA-seq,进行热图和KEGG分析,进行差异基因分析;(3)应用免疫组织化学方法检测正常卵巢组织和卵巢癌组织中CTHRC1的表达与癌组织中CD68+CD163+的肿瘤相关巨噬细胞浸润密度的关系;(4)使用淋巴细胞分离液对人外周静脉血进行密度梯度离心,抽取白膜层,随后应用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导,获得巨噬细胞Mφ;(5)选取卵巢癌细胞系SKOV3,慢病毒稳定转染构建CTHRC1敲低和过表达组的细胞系,应用重组蛋白r CTHRC1和肿瘤细胞培养上清与M-CSF诱导的人外周血单核细胞进行共培养;Western blot法、流式细胞术和RT-PCR检测M2型巨噬细胞表面标记CD163和CD206的表达情况;(6)western blot法检测M-CSF诱导的Mφ中βcatenin和p STAT6的表达情况;(7)巨噬细胞与肿瘤细胞SKOV3和HO8910共培养,应用CCK8、Transwell和细胞黏附实验检测卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移和黏附能力的变化结果:(1)腹腔注射肿瘤细胞后,小动物活体成像显示,小鼠体内的荧光信号随天数增加而增强,第3天时,体内的荧光信号位置开始集中到上腹部;(2)转录组测序筛选出卵巢癌转移前微环境形成过程中的差异基因有22个,其中CTHRC1在24h vs con组和day3 vs 24h组中表达上升,说明CTHRC1在转移前微环境的形成过程中发挥作用;(3)CTHRC1的表达与CD68+CD163+肿瘤相关巨噬细胞浸润密度和肿瘤分期密切相关(P=0.002),同时,CTHRC1的表达与CD68+巨噬细胞及CD163+M2型肿瘤相关巨噬细胞的浸润密度均成正相关(P=0.029,P=0.004);(4)重组蛋白r CTHRC1和肿瘤细胞上清与M-CSF诱导的巨噬细胞共培养后,western blot、流式细胞术和RT-PCR检测M2型巨噬细胞表面标记的表达情况,与对照组相比,r CTHRC1组和过表达CTHRC1组中CD163和CD206表达量显著性上升(P<0.05);(5)western blot检测经过r CTHRC1和培养上清处理后的巨噬细胞,跟对照组相比,过表达组和重组蛋白组中βcatenin表达量(P<0.05)和STAT6磷酸化水平(P<0.05)明显升高;(6)与Mφ共培养后,卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力明显增强(P<0.05)。结论:通过建立C57BL/6小鼠转移前微环境的模型,筛选出与卵巢癌转移前微环境形成相关的差异基因,对其中具有表达差异较大的CTHRC1进行下一步研究发现卵巢癌中高表达CTHRC1,并且CTHRC1的表达与CD68+CD163+肿瘤相关巨噬细胞的浸润密度密切相关,与卵巢癌的分期密切有关;在分子水平上,CTHRC1过表达可促进肿瘤相关巨噬细胞极化,可能通过与Wnt/βcatenin相互作用进一步提高STAT6磷酸化水平相关,参与对卵巢癌细胞侵袭转移能力的增强。
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