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DNA是染色体的主要成分之一,作为生物体遗传物质的主要承载者,其通过复制、转录等过程将遗传信息从亲代传递到子代。然而强紫外辐射会导致DNA紫外损伤,诱发相邻的嘧啶碱基之间形成共价键,产生二聚体光产物。这种光产物的积累影响了遗传信息的传递,阻碍了蛋白质功能的发挥,导致机体的病变甚至引发个体的死亡。光修复酶是负责DNA紫外损伤修复的一种酶,它能够专一有效地催化嘧啶二聚体之间的共价键断裂,恢复碱基的单体结构。根据光产物中碱基之间共价键连接的方式不同,光修复酶可分为环丁烷嘧啶二聚体光修复酶(cyclobutane pyrimidine dimers photolyase,简称CPD光修复酶)和嘧啶-嘧啶酮(6-4)光修复酶(pyrimidine-pyrimidone(6-4)photoproduct photolyase,简称(6-4)光修复酶)。目前,针对光修复酶的研究主要集中在微生物、藻类和高等植物中,在哺乳动物中尚未发现光修复酶的存在。当人体皮肤细胞经UV-B照射后,DNA损伤若得不到及时修复,皮肤将会出现红肿、炎症、甚至癌变等多种问题。南极气候恶劣,是紫外辐射较强的地区之一,其极端的生存环境给植物的生长带来了严峻的挑战。苔藓是南极地区物种数量最多,分布面积最广的绿色植物,由于其独特的抗逆机制,成为了当地的优势物种。本文选取了南极黄丝瓜藓(Pohlia nutans)中对UV-B辐射响应较为强烈的基因PnPHR1,初步鉴定其为南极黄丝瓜藓CPD光修复酶,并对其进行了体外重组表达和功能研究。具体实验结果如下:1.南极黄丝瓜藓CPD光修复酶PnPHR1的生物信息学分析对UV-B胁迫下的南极黄丝瓜藓进行转录组测序,选取表达水平上调幅度较大的基因。序列分析表明该基因全长为1830bp,编码609个氨基酸,蛋白质相对分子量为69.1KDa。通过生物信息学软件对该基因功能进行预测,初步确定其为Ⅱ型CPD光修复酶基因,将其命名为PnPHR1。通过多序列比对和进化树的构建,初步表明PnPHR1属于隐花色素/光修复酶家族,其氨基酸序列与小立碗藓的光修复酶序列相似性最高,相似度为68.0%。在系统进化树中,PnPHR1与小立碗藓的光修复酶类聚在一起,表明两者之间亲缘关系相近。蛋白质的三维结构模拟显示PnPHR1的N端为α/β结构域,C端为α螺旋区,催化辅基FAD位于α螺旋区中与损伤的DNA分子结合。2.南极黄丝瓜藓CPD光修复酶活性检测构建重组表达载体,在BL21(DE3)中诱导表达并分离纯化PnPHR1蛋白。利用UV-B胁迫处理Oligo(dT)16溶液,使其形成CPD寡聚核苷酸(OD260由1.6降至0.36)。以CPD寡聚核苷酸为反应底物,加入PnPHR1重组蛋白反应4h后,体系的OD260值增加了 0.22,而对照组体系吸光度不变;表明,PnPHR1可以修复CPD寡聚核苷酸,使其二聚体之间的共价键断裂,恢复嘧啶单体结构。SY2是大肠杆菌CPD光修复缺陷型菌株(JM107△phr::Cmr△uvrA::Kmf△recA::Tetr),对UV-B辐射较为敏感。PnPHR1使UV-B照射后SY2的存活率由4.4%提高到了17.4%。HaCaT是人永生化角质形成细胞,经PnPHR1蛋白酶孵育后的HaCaT细胞UV-B照射后,细胞损伤状态有所改善,显著提高细胞存活率;表明,PnPHR1能够缓解UV-B损伤后HaCaT的细胞形态,提高细胞存活率。3.南极黄丝瓜藓PnPHR1在非生物胁迫中的功能研究将PnPHR1与pRI101载体连接,利用农杆菌转化法将重组载体导入拟南芥体内,获得组成性过表达PnPHR1拟南芥,探究PnPHR1对拟南芥响应UV-B、NaCl、H2O2等非生物胁迫的影响。正常情况下,各株系拟南芥生长状态良好,颜色鲜亮、表面积大、形态舒展、叶茎粗壮;进行DAB染色发现(颜色深浅与植物体内的H2O2含量呈正相关),各株系之间着色没有较大差异。经UV-B照射12h后,野生型拟南芥长势受到了明显抑制,叶片发黄萎缩、茎秆细小,其DAB染色较深;过表达拟南芥较野生型叶片舒展、颜色泛绿,DAB染色着色较浅。qRT-PCR结果显示,UV-B胁迫下过表达系中紫外信号传导通路上的相关基因(AtCOP1和AtUVR2)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)基因(AtCAT1和AtFe-SOD1)表达量均显著增加。以上结果表明,PnPHR1通过增强植物紫外信号传递和抗氧化酶基因的表达,减少了体内氧化产物的积累,从而降低了植物的氧化损伤。此外,NaCl胁迫处理后,与野生型相比,过表达系的根长更长,qRT-PCR结果显示其通过调控离子转运蛋白基因AtNHX1、AtHKT1和AtP5CS的转录水平从而增强了过表达PnPHR1拟南芥对NaCl的抗性。UV-B胁迫和盐胁迫都会引起氧化胁迫,进一步研究了PnPHR1对植物响应氧化胁迫的影响。在0.75mM H2O2处理下,野生型拟南芥Co1-0的平均根长为1.48cm,而AtOE1和AtOE2的平均根长分别为2.35cm和2.26cm;在1mM H2O2处理下,AtOE1和AtOE2的根长分别是Co1-0的1.73和1.75倍。qRT-PCR结果显示PnPHR1降低了植物内源性与ROS合成相关基因(AtRbohC和AtRbohE)的表达。综上所述,南极黄丝瓜藓CPD光修复酶PnPHR1可以修复CPD寡聚核苷酸,提高UV-B照射后SY2和HaCaT的存活率。过表达PnPHR1拟南芥通过调节体内紫外信号传递和抗氧化酶基因的表达,增强了植株对UV-B的抗性;通过对离子转运蛋白基因的调控,提高了植物对NaCl的抗性;通过减少植物体内ROS的积累降低了过表达拟南芥对H2O2的敏感性。本论文初步研究了一个南极黄丝瓜藓CPD光修复酶的催化活性和生物学功能,对于揭示南极陆生植物抗UV-B辐射的分子机制和光修复酶基因的产业化应用以及极地丰富生物资源的开发利用提供了理论基础。