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研究背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床常见病,发病率高。由于急性胰腺炎发病急,病情发展快而复杂,可从最初的胰腺组织的局部病变迅速发展成为全身炎症反应综合征(systematic inflammatory response syndrome, SIRS)、脓毒症、脓毒症休克乃至多器官功能衰竭,甚至死亡,治疗非常棘手,虽然临床采用综合疗法进行治疗,但效果并不满意,总体死亡率仍然高达5%~13.6%,因此研究新的有效药物具有重要意义。目的:急性胰腺炎是由各种原因引起的全身炎症反应综合征,脓毒症是由感染因素导致的SIRS,又称SIRS亚型。鉴于SIRS贯穿急性胰腺炎的病理生理过程,早期阶段的SIRS如果得不到有效控制,晚期将出现脓毒症、脓毒症休克,发生多器官功能衰竭的风险将大为增加,病死率也将增加4~5倍。因此,急性胰腺炎的本质是SIRS和脓毒症。青蒿琥酯(artesunate,AS)为有效的抗疟药物。前期我们课题组发现,青蒿琥酯可显著提高脓毒症模型动物的存活率,显著降低模型小鼠体内血清内毒素、血清TNF-α、IL-6等炎症细胞因子的水平。鉴于急性胰腺炎的本质是SIRS和脓毒症,而青蒿琥酯具有良好的治疗SIRS和脓毒症作用,我们开展了青蒿琥酯治疗AP的研究:在建立雨蛙素联合脂多糖致AP小鼠模型的基础上,进行青蒿琥酯对急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用研究。研究方法:1.青蒿琥酯对急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用⑴急性胰腺炎模型小鼠的制模方法采用雨蛙素联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)致小鼠急性胰腺炎模型:用剂量为100μg/kg的雨蛙素对小鼠进行腹腔注射,连续6次给药,每次需间隔1小时,在最后一次注射雨蛙素后立即腹腔注射剂量为10mg/kg的LPS,完成造模。⑵青蒿琥酯对急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用将60只昆明种小鼠随机分为正常组、模型组和AS治疗组,每组12只,其中治疗组为3个浓度(AS5.0mg/kg,AS2.5mg/kg,AS1.5mg/kg)的AS组。正常组小鼠给予生理盐水;模型组小鼠在造模后,平行给予生理盐水;治疗组在造模完成后0小时和4小时肌肉注射不同浓度的青蒿琥酯。在造模完成后18小时,所有组别的小鼠采取眼眶取血,脱臼处死小鼠,留取胰腺组织,并进行以下工作:①胰腺和周围组织的大体形态学观察;②胰腺组织病理学评分:取胰腺头部进行HE染色,镜下观察其组织形态学,并采用双盲法按Rongione法对胰腺组织病理学评分;③计算胰腺系数:胰腺系数=胰腺湿重(毫克)/小鼠体重(克);④组织、血清生化指标检测:用试剂盒测定胰腺组织中胰蛋白酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,以及血清淀粉酶(amylase,AMS)活力。采用软件SPSS16.0对所测得的数据进行统计学分析。2.青蒿琥酯对重症急性胰腺炎模型(SAP)大鼠的治疗作用⑴重症急性胰腺炎模型大鼠模型的制作方法采用逆行性胆胰管注射3.5%牛黄胆酸钠方法建立SAP大鼠模型。⑵青蒿琥酯对重症急性胰腺炎大鼠模型的治疗作用。将48只SD大鼠随机分为正常组、假手术组、SAP模型组,AS治疗组(5.00mg/kg,3.5mg/kg,1.75mg/kg,0.7mg/kg)和乌司他丁(US)组,每组6只。除正常组以外,各组采用逆行性胆胰管注射牛黄胆酸钠方法制作SAP大鼠模型后,4个AS组在0小时和4小时给予不同剂量的青蒿琥酯治疗,连续三天给药,每次间隔24小时。US组造模后平行给予乌司他丁制剂10000U/kg。正常组不给予任何操作,假手术组造模后平行给予生理盐水。第三天给药结束后,采用腹主动脉取血,同时摘取胰腺组织做病理学检查、生存曲线及各项生化指标检测,主要包括胰腺系数、组织脂肪酶活力和SOD活力、组织MDA含量,血清AMS活力等。3.青蒿琥酯对急性胰腺炎治疗作用的分子机制研究⑴大鼠胰腺腺泡细胞分离和培养采用胶原酶消化法分离SD大鼠原代胰腺腺泡细胞,将细胞分为正常组、脂多糖组、AS干预脂多糖组、AS组。脂多糖终浓度为1μg/mL,AS干预组先加入终浓度为10μg/mL的AS,2h后加入脂多糖孵育。加入脂多糖6h后进行指标检测.⑵各项指标检测①应用半定量RT-PCR和ELISA法分别检测AS处理对LPS诱导的大鼠胰腺腺泡细胞TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表达及蛋白释放的影响。②应用半定量RT-PCR技术检测大鼠胰腺腺泡细胞经青蒿琥酯或LPS处理前后,其TLR2、TLR4和p65mRNA表达的变化情况。主要结果:1.青蒿琥酯对重症急性胰腺炎大鼠模型的治疗作用⑴胰腺组织观察:不同剂量AS组小鼠和大鼠胰腺组较模型组血管充血情况减轻、出血点明显减少,颜色接近正常组,胰腺系数较模型组有显著降低。⑵胰腺组织的病理学评分:①AS组的胰腺组织较模型组在坏死、出血和炎性浸润方面较模型组小鼠和大鼠有不同程度的减轻。②Rongione法病理学评分结果:治疗组与模型组相比,胰腺损伤的组织病理学评分均降低,有显著性差异(P<0.05),各AS组间有一定的量-效关系趋势,但各组间无显著差异(P>0.05)。⑶组织、血清生化指标检测:①组织脂肪酶、蛋白酶和SOD活力、MDA含量测定:与正常组比较,模型组小鼠组织胰脂肪酶、胰蛋白酶活力和MDA含量有显著增加(P<0.01),AS组与模型组比较,其各项指标都有降低(P<0.05),各AS组间有一定的量-效关系趋势,但各组间无显著差异(P>0.05)。同时与模型组比较,AS组的SOD活力有明显升高。②模型组的AMS活力较正常组明显升高,而AS各组较模型组有明显降低。2.青蒿琥酯对重症急性胰腺炎大鼠模型治疗作用的机制研究。⑴青蒿琥酯能够抑制由LPS诱导的促炎性因子IL-1β和IL-6的分泌。⑵青蒿琥酯对LPS诱导产生的急性胰腺炎大鼠胰腺细胞的TLR2、TLR4和p65的表达产生抑制作用。结论:1.青蒿琥酯能明显改善急性胰腺炎模型小鼠胰腺组织的病变情况,可显著降低其血清淀粉酶、胰腺组织脂肪酶和蛋白酶的活力,增加组织的SOD活力以及降低组织MDA含量。2.青蒿琥酯能明显改善重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺组织的病变情况,可显著降低其血清淀粉酶、胰腺组织脂肪酶的活力,增加组织的SOD活力以及降低组织MDA含量。3.青蒿琥酯治疗急性胰腺炎的作用机制与抑制LPS诱导的TLR2、TLR4和NF-κB表达,从而减少前炎症细胞因子IL-1β及IL-6的释放有关。