论文部分内容阅读
背景及目的:结肠腺癌（COAD）是世界上第二个最常见的恶性肿瘤,也是癌症相关死亡的第三大原因。尽管结肠腺癌的治疗取得了长足的进步,但结肠腺癌患者的预后仍较差。进一步阐明结肠腺癌发生发展的分子机制对于寻找新的治疗靶点和改善结肠腺癌患者的预后有非常重要的意义。过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs）是核激素受体超家族的关键成员之一,是一组由天然配体和合成配体激活的转录因子。研究表明PPARs在肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。然而,PPARs对结肠癌术后患者预后的预测作用仍未明确。核受体亚家族1组D成员1（NR1D1）是配体调控转录因子核受体超家族中的一员,有研究表明,NR1D1是PPARγ在成脂级联转录因子中的一个的靶基因,并且是调节脂肪细胞功能的重要因子。但是,NR1D1在结肠腺癌中的表达情况及其作用目前尚不清楚。在本研究中,我们通过生物信息学方法分析了PPAR通路对结肠腺癌患者预后的预测价值,进而基于PPAR通路中与患者预后显著相关的基因构建结肠癌风险评分预后模型,并通过生物信息学分析和免疫组织化学方法对风险评分预后模型中的基因NR1D1在结肠癌中的表达和临床意义进行分析,为确定NR1D1作为结肠癌的潜在诊断指标和治疗靶点提供理论依据。方法:1、在第一部分研究中,我们应用基因集富集分析方法（GSEA）分析GEO数据库中的4个COAD数据集（GSE6988、GSE14297、GSE15781和GSE44076）中PPAR相关通路和其下游靶基因在COAD患者中的表达情况。应用单变量和多变量Cox比例风险回归分析确定PPAR通路中与COAD患者预后最密切相关的基因,并利用这些基因构建COAD的风险评分预后模型,我们将该预后模型命名为PPAR-Riskscore。应用Kaplan-Meier（K-M）方法和接受者操作特征（ROC）曲线下面积评估该模型的有效性。根据风险评分中位数,将患者分为高风险和低风险两组。使用基因集变异分析（GSVA）方法分析PPAR预后风险模型的潜在生物学功能。应用反卷积机器学习方法（CIBERSORT算法）分析了高风险和低风险两组患者的基因组变异和肿瘤浸润免疫细胞情况的差异。通过R包“p RRophetic”在GDSC数据库中分析5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂三种药物对COAD的半数最大抑制浓度（IC50）值与PPAR-Riskscore之间的关系。最后,使用“rms”和“survival”R包构建了基于PPAR-Riskscore和TNM分期组成的列线图（nomogram）。并且通过DCA分析和校准图（calibration plot）方法评估了该列线图的临床应用价值。2、在第二部分研究中,首先在TCGA数据库中筛选并比较了COAD和癌旁组织中NR1D1的m RNA表达差异;然后,分析了NR1D1与COAD患者的预后相关性;最后,采用免疫组织化学方法检测NR1D1在我院62例COAD样本中的表达,并分析NR1D1与COAD临床病理参数的相关性。结果:1、基于GEO数据库发现PPAR通路及其下游靶基因在COAD中普遍处于抑制和下调状态。通过Cox比例风险回归分析,最终确定了4个与COAD患者预后密切相关的基因,分别为核受体亚家族1组D成员1（Nuclear receptor subfamily 1group D member 1,NR1D1）,整合素连接激酶（Integrin linked kinase,ILK）,肿瘤坏死因子受体超家族（The tumor necrosis factor receptor superfamily,member 1A,TNFRSF1A）,and肾素（renin,REN）。基于这4个基因构建的PPAR-Riskscore是COAD患者的一个独立的预后风险因素。Kaplan-Meier（K-M）曲线显示低PPAR-Riskscore患者的总生存明显优于高PPAR-Riskscore患者（P＜0.001,HR:3.54,95%CI:2.15-5.82）,并且PPAR-Riskscore对COAD患者预后有较好的预测能力。GEO数据库中的6个外部数据集验证了PPAR-Riskscore在预测COAD患者预后方面的有较好的鲁棒性（Robust）。2、糖脂代谢、ECM受体相互作用、轴突引导和局灶性粘连等通路在PPAR-Riskscore高的COAD患者中显著激活（P＜0.01）。CIBERSORT算法分析结果显示PPAR-Riskscore高的COAD患者巨噬细胞M0比例显著升高（P＜0.001）,而PPAR-Riskscore低的COAD患者CD4+T记忆细胞比例明显升高（P＜0.001）。3、PPAR-Riskscore越高的患者,5-氟尿嘧啶的IC50值越低（R=-0.312,P＜0.001）。伊立替康和奥沙利铂与PPAR-Riskscore无明显相关性。4、列线图具有很好的预测能力并且它的临床适用性可超过其他临床特征。5、在TCGA队列中:（1）NR1D1基因在COAD样本中的表达水平显著高于正常结肠组织样本（P＜0.001）。在COAD中NR1D1表达水平与TNM分期显著相关（P＜0.001）。（2）多因素Cox分析结果显示NR1D1表达水平与COAD患者总生存期（OS）显著相关（HR=1.475,95%CI:1.020-2.189,P=0.048）。Kaplan-Meier法分析结果表示,高表达的NR1D1与较差的OS（P＜0.001）、较短的DSS（P＜0.05）和PFI（P＜0.001）均显著相关。（3）在线数据库预测及表达分析显示hsa-mir-432-5p和hsa-mir-423-5p可能是NR1D1的潜在上游调控因子。6、在免疫组化中,NR1D1在COAD组织的表达水平明显高于癌旁组织,且NR1D1表达水平与肿瘤TNM分期、N分期、M分期和年龄显著相关（P＜0.05）。并且NR1D1低表达组的术后中位生存时间明显优于高表达组（67.5个月vs 61.4个月,P=0.029）。多因素Cox回归分析显示:TNM分期（P=0.043,HR:3.458,95%CI:1.04-11.494）和NR1D1表达水平（P=0.017,HR:2.461,95%CI:1.171-5.172）均是总生存期的独立预后因子。结论:1、基于4个PPAR相关基因（NR1D1、ILK、TNFRSF1A、和REN）建立的风险评分预后模型（PPAR-Riskscore）是COAD患者预后的独立预测因素;2、纳入PPAR-Riskscore风险评分参数后的列线图生存预测模型具有良好的COAD患者预后预测价值;3、NR1D1是与COAD患者OS最显著相关的PPAR通路相关基因;4、NR1D1是COAD患者OS的独立预测因子,NR1D1高表达的COAD患者预后较差,NR1D1基因的表达水平可能是COAD患者潜在的预后评估的生物学标志物;5、hsa-mir-432-5p和hsa-mir-423-5p可能是NR1D1的潜在上游调控因子;6、NR1D1参与COAD的发生发展,可能是COAD治疗的潜在靶点。