单倍体胚胎干细胞的建立为哺乳动物遗传学研究开辟了新的手段。孤雄单倍体胚胎干细胞(AG-haESCs)可以进行卵母细胞注射(intracytoplasmic AG-haESC injection，ICAHCI技术)并代替精子使其发生“受精”，进而产生半克隆小鼠（semi-cloned mouse，SC小鼠），这一技术也称半克隆技术。CRISPR-Cas9的出现为实现基因编辑的高效性和简便性带来了无限光明，其文库的建立以及细胞水平的大规模筛选将CRISPR-Cas9技术推向一个更高的层次。为此，是否能结合半克隆和CRISPR-Cas9技术实现多基因编辑动物模型的快速制备和哺乳动物个体水平的遗传筛选？然而，ICAHCI产生正常半克隆小鼠的效率极低（只有～2％）。据此，我的博士学论文首先集中在寻找导致半克隆小鼠出生效率低的根源并建立相应的对策。　　之前的研究发现，培养的AG-haESCs和发育阻滞的SC小鼠均会出现H19-DMR的甲基化的异常擦除。通过建立H19-DMR KO(H19△DMR)的单倍体细胞系并进行ICAHCI表明:正常SC小鼠的出生效率得到提高。然而，发育异常的SC小鼠中其IG-DMR甲基化发生完全擦除，暗示其异常的去甲基化可能是导致SC胚胎发育失败的另一个关键原因。为此，我们采用CRISPR-Cas9技术在H19△DMR细胞中敲除IG-DMR并获得了DKO-AG-haESCs。ICAHCI结果显示，SC小鼠的出生效率提升至23％左右（接近球形精子的“受精”效率）。为进一步验证此结果，我们采用另外两种方案:(1) IG-DMR KO(IG△DMR)的单倍体细胞系（SC小鼠出生效率1％-2％）中敲除H19-DMR获得DKO-AG-haESCs;(2)对已无“受精”能力的AG-haESCs进行H19-DMR和IG-DMR的敲除获得DKO-AG-haESCs;这两类细胞均能高效支持SC小鼠的产生，进一步证明H19-DMR和IG-DMR的异常甲基化是AG-haESCs具有高效“受精”能力的两大障碍。　　接着，结合CRISPR-Cas9技术和DKO-AG-haESC介导的半克隆技术，我们实现了Tet家族和P53家族多基因敲除以及Tet家族三基因敲入小鼠的快速制备。之后，我们尝试结合CRISPR-Cas9文库和半克隆技术实现小鼠个体水平的遗传筛选。首先，将CRISPR sgRNA文库通过慢病毒的方式导入到单倍体细胞并进行Cas9瞬转表达，然后通过ICAHCI一步获得携带不同突变的杂合子小鼠文库。为了获得双等位基因突变的小鼠文库，我们将突变的单倍体细胞库进行ICAHCI后，进一步向半克隆胚胎中注入Cas9 mRNA使卵母细胞的基因组也发生突变。为简化显微操作流程，我们建立Cas9和sgRNA均稳定表达的细胞系，通过ICAHCI一步得到大量双等位基因突变的SC小鼠。这些结果显示，CRISPR-Cas9文库结合半克隆技术可实现一步获得大量携带不同突变基因的SC小鼠，为进一步小鼠个体水平的遗传筛选研究提供了技术保障。　　此外，我们对孤雌单倍体胚胎干细胞(PG-haESCs)的“受精”能力也非常感兴趣。由于PG-haESCs携带着卵母细胞的基因组并部分维持着卵子的表观特性，因此其无法通过卵母细胞注射的方法（intracytoplasmic PG-haESC injection，ICPHCI技术）获得后代。通过RNA-seq的分析，发现PG-haESCs全基因组和印记基因的表达谱与AG-haESCs极为相似。而印记基因甲基化的分析，同样表明:PG-haESCs与AG-haESCs具有相似的印记甲基化状态。根据之前的研究H19-DMR和IG-DMR的甲基化状态决定AG-haESCs的“受精能力”，我们在PG-haESCs中对H19-DMR和IG-DMR进行敲除并获得了DKO-PG-haESCs。随后，通过孤雌单倍体卵母细胞注射（ICPHCI技术）实验高效获得SC小鼠。此工作简化了半克隆技术，并从理论上证明可高效实现哺乳动物的孤雌生殖。　　最后，本博士学位论文还探讨了人孤雌单倍体胚胎干细胞系的建立方法。通过去除受精卵中雄原核的方法，并结合人胚胎干细胞的体外建系，最终我们成功分离到2株人孤雌单倍体胚胎干细胞系。借助于流式分选富集，我们能够在体外长期维持其单倍体特性性。细胞的核型以及CNV(chromosome numbervariation)芯片的结果显示人孤雌单倍体胚胎干细胞基因组的完整性。并且，这类单倍体细胞能够维持胚胎干细胞的多能性。此外，RNA-seq表达谱和全基因组甲基化芯片分析证明了人孤雌胚胎干细胞的多能性以及雌性印记的维持特性。此项研究首次证明去除雄原核建立人单倍体胚胎干细胞的可行性。