【摘 要】
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大豆种子中的油脂以三酰甘油（Triacylglycerol,TAG）的形式存在,而3-磷酸甘油酰基转移酶（GPAT）催化的第一步酰化反应是TAG合成途径中的限速步骤;目前,尚不清楚大豆中的GPAT酶由哪些基因编码。本研究从大豆中克隆到18个Gm GPATs基因,并运用酵母遗传互补体系鉴定了Gm GPATs家族不同成员的酰基转移酶活性,将具有酰基转移酶活性的Gm GPAT在拟南芥中异源表达,探究其是
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大豆种子中的油脂以三酰甘油（Triacylglycerol,TAG）的形式存在,而3-磷酸甘油酰基转移酶（GPAT）催化的第一步酰化反应是TAG合成途径中的限速步骤;目前,尚不清楚大豆中的GPAT酶由哪些基因编码。本研究从大豆中克隆到18个Gm GPATs基因,并运用酵母遗传互补体系鉴定了Gm GPATs家族不同成员的酰基转移酶活性,将具有酰基转移酶活性的Gm GPAT在拟南芥中异源表达,探究其是否对油脂合成产生影响;同时,对具有酰基转移酶活性的Gm GPAT基因的时空表达特性及其在激素处理下的表达模式进行分析,初步明确Gm GPAT基因的功能。主要研究结果如下:1.本研究从大豆中分离出18个GPATs基因。对其进行生物信息学分析,发现Gm GPATs进化上聚成三大分支:Gm GPAT1-1/2-1/2-2/2-3/2-4/3-2/3-4/6-1/6-2/6-3/6-4/8-1/8-2,Gm GPAT9-1/9-2/9-3和Gm ATS1-1/-2,不同支系基因存在功能分化,它们所编码的蛋白羧基端均含有4个酰基转移酶保守结构域。经酵母遗传互补体系的验证,发现Gm GPAT9-2转化ZAFU1直接涂布于SC-Ura-His-Leu+Glucose培养基后能恢复其的生长,而Gm GPAT1-1从SC-Ura-His-Leu+Galactose培养基中挑取转化的单克隆进行酵母浓度梯度稀释试验时,在菌液浓度较大时(OD600=1.0),部分单克隆能恢复酵母双突变体在SC-Ura-His-Leu+Glucose培养基上的生长。但生长状态显著弱于阳性对照和异源表达Gm GPAT9-2的菌株。表明Gm GPAT9-2具有较高的酰基转移酶活性,而Gm GPAT1-1具有较低的酰基转移酶活性。2.为了明确Gm GPAT9-2基因的异源表达对油脂合成的影响,本研究构建了Gm GPAT9-2的种子专一型及组成型植物表达载体,通过花序侵染法进行拟南芥的遗传转化。通过抗生素的筛选,分别获得种子专一型和组成型表达载体的T3代纯合单插入位点株系21株和25株。经荧光定量PCR对T3代纯合转基因株系的表达量进行测定,对表达量较高的五个株系收获的T4代纯合种子的含油量和脂肪酸组分进行分析,发现其含油量和脂肪酸组分与野生型相比无显著差异。3.为了进一步了解Gm GPAT9-1/9-2/9-3基因的表达模式,本研究运用q RT-PCR对Gm GPAT9-1/9-2/9-3基因在茉莉酸甲酯、水杨酸和赤霉素的诱导下进行表达定量分析。发现Gm GPAT9-1/9-2对SA和Me JA有响应,Gm GPAT9-3对Me JA和GA3有响应。对Gm GPAT9-1/9-2/9-3在大豆不同组织的表达量进行测定,结果显示,Gm GPAT9-1、Gm GPAT9-2和Gm GPAT9-3基因在大豆各组织中均有表达,但是Gm GPAT9-1基因在开花后30 d胚中高表达,Gm GPAT9-3基因在开花后15 d胚中高表达,Gm GPAT9-2基因在叶、花及胚中表达量较高,并且随着大豆油脂的积累在胚中的表达量也逐渐升高。
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