鉴于中晚期恶性肿瘤常规治疗疗效有限而且副作用明显,用复制选择性溶肿瘤病毒进行癌症靶向治疗近来已引起人们广泛的关注。2005年,删除E1855K基因的5型腺病毒H101获得中国国家食品药品监督管理局(SFDA)批准上市,与化疗结合用于人头颈部恶性肿瘤的临床治疗,成为世界上第一个由官方机构正式批准的复制选择性溶肿瘤病毒药物。该病毒与常规放化疗相结合显示出非常令人鼓舞的效果,但是作为单一制剂却疗效甚微。因此,从临床实践上急需研究哪些因素影响溶肿瘤腺病毒的潜能,从而为提高其疗效寻找新的策略。　　 溶肿瘤腺病毒抗肿瘤效果取决于肿瘤细胞、病毒和机体对病毒免疫反应之间的相互作用。肿瘤发生过程中细胞内基因的变化可以导致细胞表面黏附分子和细胞内信号传导通路的改变,从而影响腺病毒感染肿瘤细胞的能力以及病毒在肿瘤细胞中的复制能力。不同组织来源、不同类型的肿瘤细胞对复制选择性溶肿瘤腺病毒(replication-selective oncolytic adenovirus,RSOA)的敏感性差异显著,充分说明肿瘤细胞内在基因的变化对RSOA的潜能有重要影响,目前该方面的研究国内外鲜见报道。通过对一系列肿瘤细胞对腺病毒敏感性的筛选,我们先前发现了一个很好的细胞模型:PaTu8988s和PaTu8988t。这一对细胞来自同一个肿瘤病人,对腺病毒的敏感性却差异显著。为了进一步发现哪些肿瘤细胞内在基因影响肿瘤细胞对腺病毒的敏感性,我们利用Affymetrix array高通量筛选技术对腺病毒非常不敏感的PaTu8988s和对腺病毒非常敏感的PaTu8988t两株细胞基因表达图谱进行了比较,结果发现Darpp-32和PRSS3是两个潜在的可能影响腺病毒潜能、且尚未报道的候选基因。为了研究这两个基因与肿瘤细胞对溶肿瘤腺病毒敏感性的关系,本课题从高表达候选基因及关闭候选基因两方面对其进行功能鉴定,并进一步研究其作用的分子机制。该研究结果为设计增强RSOA杀伤肿瘤细胞能力的新方法提供了科学理论依据和方向。本研究分以下两个部分。　　 第一部分 t-Darpp多磷酸化位点相互作用调控肿瘤细胞对腺病毒的敏感性　　 Darpp-32(dopamine and cAMP regulated phosphoprotein32)是多巴胺和cAMP活化调节的磷酸化蛋白。该基因影响多种生理过程,在神经递质受体、离子通道、离子泵以及细胞核内转录因子等众多磷酸蛋白的磷酸化、生理活性以及耐药等多方面发挥着关键的控制作用。近来发现该基因亦与人类肿瘤的发生、发展以及肿瘤细胞对一些抗肿瘤制剂的反应有密切的关系。但未见任何关于Darpp-32与病毒感染之间关系的报道。　　 从表型上看,Darpp-32在肿瘤中的表达与肿瘤细胞对腺病毒的敏感性呈负相关。进一步研究发现,在一系列人胰腺癌及结直肠癌细胞系中表达的是Darpp-32的剪切同位体t-Darpp。通过关闭t-Darpp和高表达t-Darpp两条途径进行功能性鉴定,我们首次发现,在不同的细胞系中,t-Darpp分别呈现出增强、减弱或者不影响肿瘤细胞对溶肿瘤腺病毒的敏感性三种不同的功能。鉴于Darpp-32基因中存在多个磷酸化位点,并且不同位点磷酸化在功能上相互调控从而影响其功能。我们推测,t-Darpp的磷酸化状态可能是该基因在不同细胞系中呈现不同功能的原因。为了证实我们的假说,通过免疫沉淀的方法收集不同细胞系中产生不同作用的t-Darpp纯化蛋白,用质谱检测它们的磷酸化位点。结果不仅证实了我们的假说:t-Darpp在对腺病毒敏感性不同的肿瘤细胞中存在不同的磷酸化位点,更为重要的是我们发现了一个尚未报道的、新的t-Darpp磷酸化位点。进一步功能实验证实,这些磷酸化位点的相互作用调控着肿瘤细胞对腺病毒的敏感性。此外,我们对t-Darpp如何影响腺病毒的生命周期的分子作用机制进行逐步研究,发现t-Darpp影响腺病毒在肿瘤细胞上的吸附进而影响腺病毒入核、DNA复制等细胞内的后续过程。本研究结果提示,t-Darpp多磷酸化位点相互作用调控肿瘤细胞对腺病毒的敏感性；特殊位点磷酸化的t-Darpp可能是预测肿瘤细胞对腺病毒基因治疗敏感性的生物标记物,有望成为提高腺病毒抗肿瘤效果新的治疗靶向。更为重要的是,t—Darpp新磷酸化位点的发现提示该基因可能具有其它未知的生物学功能。　　 第二部分 PRSS3不影响肿瘤细胞对腺病毒的敏感性,但促进胰腺癌细胞的生长和转移　　 PRSS3是胰蛋白酶原家族的一员,多数文献报道该基因与细胞癌变有关。从PRSS3蛋白表达的表型上看,该基因与肿瘤细胞对溶肿瘤腺病毒的敏感性相关,但是功能鉴定结果显示PRSS3并不影响腺病毒对肿瘤细胞的杀伤能力。然而在功能性鉴定PRSS3对腺病毒感染性影响的实验中,我们观察到稳定表达PRSS3的PuTa8988t细胞体外培养生长速度明显比空载体转染的细胞快。由于PaTu8988t和PaTu8988s源自同一个胰腺癌患者,转移能力却差异显著,我们推测PRSS3可能影响肿瘤细胞生长和转移。　　 本研究通过qPCR和Western Blotting检测一组人胰腺癌细胞系中PRSS3的表达；通过高表达外源性PRSS3基因观察该基因对癌细胞体外增殖、肿瘤生长和体内转移的影响；通过ELISA检测细胞VEGF的表达及PRSS3调控VEGF表达的信号传导通路；通过动物实验检测抑制该转移通路的体内治疗效果；最后,通过免疫组化检测PRSS3蛋白在人胰腺癌组织中的表达。结果发现,PRSS3在转移的PaTu8988s细胞中高表达,而在不转移的PaTu8988t细胞中不表达。进一步研究显示PRSS3通过PAR-1介导ERK磷酸化导致VEGF在肿瘤细胞中高表达,从而促进肿瘤细胞的生长和转移。MEK1／2抑制剂可以显著延缓转移的进程、延长荷瘤实验动物的生存时间(P<0.05)。最后,我们分析了PRSS3在人胰腺癌组织中的表达与临床病理因素之间的关系。结果和预期一样,PRSS3在正常胰腺腺泡细胞中表达,在正常导管上皮细胞中不表达,而在胰腺导管上皮细胞癌组织中表达。在74例胰腺导管上皮细胞癌组织中,30例(40.5％)PRSS3呈阳性表达,44例(59.5％)呈阴性表达。更有意义的是,PRSS3在浸润至血管内和淋巴管内的癌细胞中表达更高。统计学分析结果显示,PRSS3的表达与肿瘤分期、分化、患者性别和年龄无关,但是与转移(P=0.004)和预后(P=0.0404)密切相关。这些结果表明PRSS3在人胰腺癌的进展和转移过程中起重要作用。本研究所发现的PRSS3,PAR1,ERK和VEGF的信号传导通路为我们提供了PRSS3促进肿瘤进展和转移的理论依据,同时为人胰腺癌的治疗开辟了一条新途径。