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Hax1(HS-1-associated protein X-1,Hax1)最初是由Suzuki等人于1997年利用酵母双杂交技术发现的与HS1(hematopoietic lineage cell—specific protein1,HS1)相互作用的一种蛋白质。目前的研究证明,Hax1是一个多功能蛋白,在人类组织中能够发现Hax1的存在,它的功能新颖,包括抗凋亡,细胞的转移和内吞,与mRNA的3’-UTR结合等,与内质网和核膜相比,在线粒体中它的表达量较高。由于Hax1能够和多种细胞或病毒蛋白相互作用,继而参与不同的信号途径和细胞生理过程,所以,它与人类疾病的发生有着密不可分的关系。Hax1基因的缺失或是过表达都会引起人体的一些遗传性疾病或系统性疾病的变化,如癌症,牛皮癣,系统性红白狼疮(SLE),多囊肾,先天性中性白细胞减少症等,但是作用机制仍然不是非常清楚,因此进一步探讨Hax1的功能颇受关注。
本研究通过RNAi技术,构建Hax1基因特异性小干扰RNA(sihax),检测sihax对Hax1基因的表达抑制,在293细胞中研究Hax1和Hax1 siRNAs对细胞凋亡的影响,初步探讨Hax1的促凋亡功能。
本课题包括的研究内容有:1)扩增Hax1基因编码序列全长,构建pEGFP-C1-Hax1真核表达载体。2)选择Hax1基因siRNA的两个靶位点,构建Hax1 siRNA表达载体pBS/U6-siHaxA和pBS/U6-siHaxB。3)检测pBS/U6-siHaxA和pBS/U6-siHaxB对Hax1基因表达的影响。4)检测Hax1基因特异性siRNAs对EGFP—Hax1融合基因表达的影响。5)检测Hax1及其siRNA对293细胞凋亡的影响。
本实验中,以pCMV-Myc-Hax1为模板,PCR扩增出Hax1基因编码序列全长,克隆入pEGFP-C1真核表达载体；选择人源Hax1基因siRNA的靶位点(300-320和860-880),根据已发表的siRNA靶序列设计原则,以及NCBI中Hax1的cDNA序列,经过BLAST分析,合成两条特异性靶序列,克隆入pBS/U6分别构建pBS/U6-siHaxA和pBS/U6-siHaxB表达载体；pCMV-Myc-Hax1、pEGFP-C1—Hax1、pBS/U6-siHaxA和pBS/U6-siHaxB经过不同分组后转染293细胞,在倒置荧光显微镜下观察EGFP-Hax1融合基因表达水平确定Hax1在293细胞的定位,并观察Hax1基因特异性siRNAs对EGFP-Hax1融合基因表达的影响;利用流式细胞仪AnnexinV-EGFP/PI双染法检测293细胞凋亡比例；通过RT-PCR方法和Western—blot方法检测Hax1 mRNA在293细胞中的表达水平。
结论:在本实验中,成功构建了pEGFP-C1-Hax1真核表达载体,在293细胞中过表达的EGFP-Hax1融合蛋白主要分布于细胞浆。通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达,以及RT-PCR和Western-blot检测内源性Hax1表达,显示成功构建两个Hax1的siRNA真核表达载体(pBS/U6-sittaxA和pBS/U6-siHaxB)有抑制效果,siHaxB对靶基因的抑制作用明显强于siHaxA。并且Hax1 siRNA抑制内源性Hax1的表达可显著增加晚期细胞凋亡比例,并显著抑制细胞的早期凋亡过程,根据以上结果,我们认为Hax1在凋亡的不同阶段发挥作用不同,其功能的复杂性表现在在同一种组织细胞中有可能发挥两种完全相反的作用。Hax1 siRNA对靶基因的抑制作用与靶序列的保守性有一定相关性,Hax1基因在细胞中参与凋亡相关的多种调节过程,本研究为进一步探讨Hax1功能奠定了基础。