研究背景唇腭裂,亦称口面裂(orofacial clefts,OFC)是最常见的人类先天出生缺陷,患者常表现出不同程度的唇、腭部畸形。患儿自出生至成年都需要接受多阶段治疗和多学科护理,由此给患者及其家庭带来不同程度的心理负担[1-3]。流行病学研究显示唇腭裂发病率存在种族差异,黑种人最低约为1/2500,白种人居中约为1/1000,而黄种人(尤其是中国人和日本人)则最高约为1/500。依据患者是否伴发其他全身性畸形或异常,唇腭裂可分为综合征型和非综合征型。而依据患病部位的解剖形态,唇腭裂又可划分为:唇裂伴腭裂(cleft lip with palate,CLP)、单纯唇裂(cleft lip only,CLO)和单纯腭裂(cleft palate only,CPO)三大类。由于唇裂伴腭裂亚表型与单纯唇裂亚表型的流行病学特征和胚胎学发生机制存在部分重叠,一般情况下,二者也可并称为唇裂伴或不伴腭裂(cleft lip with or without cleft palate,CL/P)而归之为一类[4-6]。约70%的CL/P和50%的CPO因单独发病不伴有其他畸形和异常,而归于非综合征型。OFC在疾病性别组成方面也存在差异,一致的研究结果显示,唇裂伴或不伴腭裂男女比例约为2:1,而单纯腭裂男女比例约为1:2[4,6]。唇、腭的发育是由一系列复杂过程紧密协调配合完成的。病因学研究结果显示,唇腭裂的发生存在多重因素,涵盖遗传因素、环境因素以及基因-环境的交互作用。长久以来,遗传因素被认为是唇腭裂发生的最重要依据。双胞胎研究和家系共分离研究均提示唇腭裂的发生具有明显的遗传倾向,表现出较强的家族聚集性[7-9]。候选基因表达[10,11]、染色体异常检测[12]、基因测序[13,14]、连锁分析[15,16]和关联分析[17-19]等多种研究手段亦从不同角度证实了遗传作用。然而,鉴于遗传模式的复杂性、异质性和样本量受限等,致病性候选基因的确定仍然艰难。流行病学和实验性数据显示唇腭裂的产生与环境危险因素,如与患者母亲孕早期暴露于烟酒和污染的环境、营养缺乏、病毒感染、服用药物以及致畸因子等之间可能存在重要[4,20];同时,有研究表明,孕早期服用维生素与降低唇腭裂风险存在关联[21]。这些证据在一定程度从正反两面说明了环境因素与唇腭裂的关联。相关研究报道了吸烟和TGFA[22,23],吸烟和TGFB3[24],吸烟和IRF6[25],以及吸烟和GSTT1、NOS3[26]对NSOFC的发生有交互作用;同时,饮酒和ADH1C也被报道对NSOFC的发生有交互作用[27]。这些研究为唇腭裂提供了很多重要的病因线索,为进一步的深入研究打下了坚实的基础,但上述各研所究报的道结论多不一致,或尚有待更多的研究加以证实。NSOFC作为一种多因素共同作用而导致的复杂性疾病,针对遗传因素的研究仍然不失为其最重要的研究策略。而当前,连锁分析、功能候选基因研究等遗传学研究手段对复杂疾病病因的探索还存在一定的局限性。进而,展开针对NSOFC,尤其是在对其详细划分亚表型情况下的全基因组关联分析研究(genome-wide association study,GWAS),对于唇腭裂遗传学基础以及其发病机制的认识具有重要意义。实验目的此研究首先选择NSOFC中最严重的亚表型NSCLP,利用GWAS研究方法在全基因组范围内搜寻定位与NSCLP关联的遗传变异,鉴定出中国汉族人群NSCLP的易感位点/基因,并在多种族人群中进行验证;利用分层分析,鉴定出NSCLP、NSCLO和NSCPO表型差异关联区域/基因;通过功能性分析,定位候选基因,并综合性分析候选区域/基因与唇腭裂发生的联系。材料方法(1)利用HumanOmniZhongHua-8全基因组SNP分型芯片(900,015个SNP),在中国汉族人群中,对2,096例NSCLP样本和4,051例对照进行分型。数据严格质控后,去除不合格的样本和SNP。(2)验证阶段:①验证1:结合连锁不平衡区域,选择初筛最显著的152个SNP,在另一组独立的1,346例NSCLP样本和4,542例对照中,使用Sequenom平台进行验证。数据质控后,对两组人群的SNP分型数据进行合并Meta分析。②验证2:从NSCLP关联结果中,选择最具代表性的41个显著性关联SNP,在1,104例NSCLO样本和3,312例对照中,使用Sequenom平台进行验证。③验证3:对验证2中同样的41个SNP,在1,104例NSCPO样本和3,312例对照(与验证2为同一组对照)中,使用Sequenom平台进行验证。④表型差异比较:针对上述41个位点,对NSCLP、NSCLO和NSCPO进行表型差异比较。⑤验证4、5和6:从本研究NSCLP新发现区域中各挑选1至2个,共24个SNP在3组独立国外样本中进行验证,包括德国399例NSCL/P样本和1,318例对照,美国-亚洲人群861组NSCL/P患者父母对样本,美国-欧洲人群557组NSCL/P患者父母对样本。(3)结合每一位患者的临床资料,进行基因型-表型分层分析。(4)基于14个NSCLP新候选区域功能性分析:①区域散点图;②区域基因功能检阅:对候选区域内与标签SNP密切连锁(R2≥0.7)区域内所包含的基因,通过Pubmed数据库进行文献检索;EMAGE数据库进行基因表达查阅;MGI数据库查询转基因动物模型;OMIM搜索综合征型唇腭裂囊括的候选基因。基于26个NSCLP候选区域连锁位点/基因/蛋白的功能分析:①对区域内与index-SNP连锁关系R2 ≥ 0.7的所有位点(135个SNPs)进行ENCODE功能注释。②利用人类蛋白交互作用整合数据库分析26个候选区域候选基因间交互作用。③检索NHGRI数据库,查阅index-SNP上下游500kb内报道的显著性SNP所关联的所有疾病,结合LD分析不同疾病间可能的关系。④免疫组化表达:从显著性较强的关联区域中挑选了 5个感兴趣的基因,检测其在小鼠胚胎E13.5天至E16.5天颌面部的表达情况。结果(1)严格质控后,2,033例NSCLP样本和4,051例对照,以及803,202个SNP用于后续分析。(2)验证阶段:①验证1:质控后,146个SNP用于后续分析,Meta分析后发现14个新的NSCLP关联区域并验证了 12个既往报道NSCL/P关联区域;②验证2:质控后,40个SNP用于后续分析,15个SNP达到验证显著性水平,其分布于2个新区域和8个既往报道NSCL/P关联区域;③验证3:质控后,40个SNP用于后续分析,3个SNP达到验证显著性水平,其分布于1个新区域和2个既往报道NSCL/P关联区域;④表型差异比较:发现NSCLP与NSCLO之间存在1个差异区域,CLP与CPO之间存在8个差异区域,CLO与CPO之间存在5个差异区域。⑤验证4、5和6:质控后,达到验证显著性水平的的结果如下,德国人群3个区域(5个SNP),美国-亚洲人群7个区域(10个SNP),美国-欧洲人群5个区域(6个 SNP)。(3)分层分析后,存在基因型-表型阳性分析结果的是:NSCLP组,1q32.2区域-性别;NSCLP组,8q21.3区域-母亲孕龄。(4)14个NSCLP新候选区域:①区域散点图:连锁区域内含1至多个基因的有12个散点图,而另2个散点图连锁区域内无基因;②区域基因功能检阅:通过文献检阅,发现区域内28个基因可作用于不同的生理途过程;20个基因在胚胎发育过程中有表达,其中12个在唇腭裂相关组织表达;12个基因见之于相关唇腭裂动物模型中;7个基因可查阅被报道于9种综合征型唇腭裂。26个候选区域SNP/基因/蛋白质的功能分析:①在这135个SNP中,分别有33、99和113个SNP见于已知或预测性调控元件,如启动子、增强子和调控基序中从而参与调控50个参考基因的转录。②在蛋白交互作用分析中,共有24个候选基因密切关联。③在疾病共享分析中,19个显著性区域共享34种疾病/形状。④免疫组化表达:3个基因在唇腭发育关键部位呈阳性表达。结论(1)本研究首次利用最大样本的中国汉族人群,对NSCLP进行全基因组关联分析,发现了 14个新的候选区域,并验证了 12个NSCL/P-GWAS既往报道区域。(2)在对NSOFC三种表型间进行比较时,发现尽管有部分共性,三者间仍存在表型异质性。(3)结合国外人群验证结果,表明复杂疾病人群异质性确实存在。(4)分层分析结果揭示出lq32.2区域和性别,以及8q21.3区域和孕妇年龄对NSCLP的发生存在交互作用。(5)综合NSCLP候选区域进行全面系统的生物信息学分析后,为FGF等信号通路与NSCLP的发生提供了可靠的遗传学证据。本研究加深了对NSCLP的遗传学基础的认识,同时为NSOFC的发病机制研究提供新的遗传证据。