新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类高度接触性传染病,可导致呼吸系统、神经系统、消化道及内脏损伤,致死率可达100%。自1926年印度爪洼和英国新城相继爆发,新城疫在世界范围经历了四次大流行,给世界人民造成巨大经济损失。第三次大流行后,新城疫疫苗开始在世界范围内广泛接种,首先是II系La Sota疫苗,其后依据Mukteswar株、Clone 30株、Hitchner B1株、F株、ZJI株等研制的疫苗也相继投入使用。疫苗的广泛使用,有效抑制了新城疫在世界范围大规模流行。进入上世纪90年代基因Ⅶ型NDV逐渐成为世界范围的主要流行毒株,由于免疫疫苗的基因型与流行株基因型不匹配经常引起地方性新城疫的爆发。其后负链RNA病毒反向遗传系统成功建立,基因Ⅶ型新城疫疫苗在反向遗传平台的帮助下迅速研制出来并广泛应用。自1999年Peeters等人首次通过反向遗传的方法构建出NDV的感染性克隆至今20余年,新城疫病毒的反向操作已日趋成熟,反向平台的建立不仅加快了针对流行株疫苗的研制,也使得人们对新城疫病毒的研究更加方便和深入。本实验室2011年分离到一株NDV命名为DHN3,通过鉴定确认为基因Ⅶ型NDV。本实验以p BR322质粒为载体构建DHN3的感染性克隆,并构建p XJ40-DE3质粒代替禽痘病毒在BHK-21细胞中表达T7 RNA聚合酶,在BHK-21细胞中拯救出DHN3的重组毒r DHN3。随后,我们突变DHN3 F基因编码区第112～117位氨基酸对应的碱基序列,使其与La Sota株裂解位点的碱基序列相同,拯救获得减毒株r DHN3-m F。为研究NP基因在NDV感染与复制中的作用,我们通过统一NP基因密码子降低NP蛋白的翻译速度,希望达到减慢病毒复制效率降低病毒毒性的目的。用具单一密码子的人工合成序列替换原有的碱基序列,拯救出密码子替换株r DHN3-m NP。r DHN3-m F、r DHN3-m NP与原毒株DHN3具有相似的生长特性。将DHN3、r DHN3-m F、r DHN3-m NP、La Sota尿囊液活病毒以10~6 EID50分别感染一周龄SPF雏鸡,DHN3、r DHN3-m NP组攻毒4 d后鸡群全部死亡,剖检见心脏、肾脏、十二指肠等处肿大出血。r DHN3-m F组、La Sota组、对照组鸡群精力旺盛,采食及排泄正常。攻毒一周后剖检内脏,r DHN3-m F组和对照组鸡群健康正常,La Sota组个别雏鸡胸腺、肝脏肿大充血。攻毒7 d、14 d、21 d分别给剩余各组雏鸡采血,HI检测表明r DHN3-m F组及La Sota组雏鸡均产生NDV抗体。使用r DHN3-m F（鸡胚）、r DHN3-m F（EB66）、La Sota制备的灭活疫苗免疫一周龄SPF雏鸡,免疫3周后攻强毒DHN3,免疫鸡群产生100%保护。r DHN3-m F（鸡胚）和r DHN3-m F（EB66）组攻毒后5 d即不排毒,而La Sota组攻毒7 d后仍有排毒。分别以DHN3和La Sota为抗原检测各组抗体效价,r DHN3-m F（鸡胚）组血清抗体效价在免疫后21 d高于r DHN3-m F（EB66）组和La Sota疫苗组。DHN3、r DHN3-m F、r DHN3-m NP分别以1000PFU感染9～11日龄SPF鸡胚,q PCR检测对鸡胚免疫因子表达的影响。结果显示病毒感染鸡胚后引起I型干扰素IFN-β大量表达,同时I型干扰素IFN-β正反馈调节和负反馈调节因子NLRC5、SOCS1同步上调。减毒株在感染鸡胚后更快的诱导IFN-β表达。原毒株DHN3感染鸡胚40 h后,引起MOV10、RSAD2（viperin）等抗病毒因子表达量均显著高于r DHN3-m F和r DHN3-m NP组。在此实验中观察到与抗原递呈相关的HLA基因上调幅度最大,其中r DHN3-m NP感染引起的上调显著高于其他两组。DHN3、r DHN3-m F与r DHN3-m NP引起的不同表达可能与病毒基因组序列的改变相关,后面我们将进一步探讨。