根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种栖生于土壤中的革兰氏阴性植物病原菌,在自然条件下该菌能够引起双子叶植物的冠瘿瘤疾病。根癌农杆菌在侵染宿主的过程中可将自身Ti质粒上的T-DNA转移并整合到宿主细胞基因组中,使宿主发生遗传转化。基于这一特性,根癌农杆菌被广泛用于绝大部分双子叶植物以及部分单子叶植物的植物转基因工程中。目前,对根癌农杆菌的转化机制的研究已经较为清楚,但仍有许多未知因素影响着该菌的致瘤能力和转基因效率。其中根癌农杆菌的铁代谢平衡和抗氧化胁迫能力与其致瘤能力息息相关。铁蛋白在维持细菌细胞铁代谢平衡和应对氧化胁迫方面发挥重要作用。细菌中一般存在三种类型的铁蛋白:Ftn、Bfr和Dps,然而根癌农杆菌C58中有且仅有一种Bfr和一种Dps。与其他细菌相比,根癌农杆菌的Dps在N端缺少11个氨基酸,体外实验证明根癌农杆菌的Dps无法结合DNA但仍能发挥铁解毒的功能;根癌农杆菌的Bfr在N端多了8个氨基酸,其具体功能还未知。基于根癌农杆菌铁蛋白的独特性以及铁代谢对根癌农杆菌致病性的影响,对根癌农杆菌铁蛋白的研究具有非常重要的意义以及潜在的应用价值。本课题在实验室前期研究的基础上,利用反向遗传学的研究技术,探究了铁蛋白Bfr和Dps对根癌农杆菌的铁响应、胞内铁平衡、抗氧化性和致瘤性的影响。本课题具体取得以下研究成果:(1)通过对根癌农杆菌铁蛋白Bfr和Dps体外铁结合量和铁释放速率的测定,我们发现一个Bfr蛋白分子可以结合大约3000个铁原子,将Bfr的血红素结合位点的甲硫氨酸Met替换成亮氨酸Leu的Bfr变异体BfrM60L仍然能够结合铁,但结合能力有所下降,每个BfrM60L蛋白分子大约可以结合2300个铁原子,一个Dps蛋白分子可以大约结合500个铁原子,且Bfr的铁释放速率明显快于BfrM60L。验证了根癌农杆菌Bfr和Dps是具有储铁功能的铁蛋白且根癌农杆菌的Bfr是含血红素的细菌铁蛋白Bfr。同时我们也确定了根癌农杆菌铁蛋白的储铁量。(2)通过测定在不同铁浓度的AB-蔗糖培养基中根癌农杆菌野生株和铁蛋白缺失株(△bfr、△dps和△bfr-dps)的生长曲线和培养基中可溶性铁利用率曲线,我们发现不论在低铁还是高铁浓度条件下,铁蛋白Bfr的缺失都会影响根癌农杆菌在培养基中可溶性铁耗尽后的生长,而铁蛋白Dps的缺失则不会影响根癌农杆菌的生长。且在高铁浓度培养时,Bfr的缺失会降低根癌农杆菌对培养基中可溶性铁的利用速率。说明Bfr能够通过自身铁储存和铁释放功能来调节根癌农杆菌的胞内游离铁含量以及对环境中铁的利用速率和利用量,最终影响根癌农杆菌的生长。(3)通过对根癌农杆菌野生株和铁蛋白缺失株细胞含铁量的比较,我们发现在9μM铁浓度培养下,只有Bfr的缺失(△bfr和△bfr-dps)才严重影响细胞的储铁量,Dps的缺失(△dps)几乎不影响细胞的储铁量。在20 μM铁浓度下培养时,Bfr和Dps的缺失(△bfr、△dps和△bfr-dps)都会明显地影响细胞的储铁量。说明在调控根癌农杆菌胞内铁平衡和储铁中起着主要作用的是Bfr而不是Dps。(4)通过对根癌农杆菌野生株和铁蛋白缺失株抗氧化性的比较,我们发现在高浓度过氧化氢短时间处理时,铁蛋白的缺失(尤其是Bfr的缺失)会降低根癌农杆菌的存活率;在低浓度过氧化氢长时间处理时,铁蛋白的缺失会明显影响根癌农杆菌的生长状态。说明铁蛋白Bfr和Dps在根癌农杆菌应对氧化胁迫环境中发挥重要作用,其中Bfr对根癌农杆菌的抗氧化能力影响更为明显。(5)通过对根癌农杆菌野生株和铁蛋白缺失株的致瘤量比较,我们发现在无铁环境中,野生株和铁蛋白缺失株对土豆块茎的致瘤量基本相同;而在含铁环境中,野生株对土豆块茎的致瘤量明显高于铁蛋白缺失株。说明铁蛋白可以通过调节根癌农杆菌铁代谢平衡来影响根癌农杆菌的致瘤能力。此外,在含铁环境中,Bfr和Dps对根癌农杆菌的致瘤性的影响基本相同,而二者对根癌农杆菌储铁能力的影响明显不同。说明铁蛋白不仅仅通过调节根癌农杆菌铁代谢平衡来影响根癌农杆菌的致瘤能力,还通过其他机制影响着根癌农杆菌的致瘤性。上述结果表明,Bfr影响根癌农杆菌的铁响应、胞内铁平衡、抗氧化性和致瘤性,而Dps仅影响根癌农杆菌的抗氧化性和致瘤性,对根癌农杆菌的储铁能力影响较小。因此,Bfr相比于Dps在根癌农杆菌中发挥更重要的作用。