肝脏作为体内最大的消化器官,其重量约为人类体重的2%。肝细胞和胆管上皮细胞（biliary epithelial cells,BEC）作为肝脏的主要组成部分,参与肝脏代谢、解毒、合成胆汁等重要生理功能。稳态下,肝脏细胞相对静息,缓慢的肝细胞自我更替便可以满足肝脏代谢需求。然而,急性损伤状态下,大量新生的肝细胞迅速填充受损肝脏,最终实现肝功能的修复。尽管如此,大量患者面临着急性肝衰竭或慢性肝脏损伤导致的肝脏再生能力下降,随之而来的肝脏纤维化及终末期肝病（end stage liver disease,ESLD）成为临床治疗中亟待解决的问题。由于供体肝脏的短缺,原位肝移植（orthotopic liver transplantation,OLT）作为终末期肝病行之有效的治疗策略备受限制。因此,寻找有效的替代治疗方案成为治疗终末期肝病的迫切需求。随着干细胞与再生医学的发展,细胞治疗在终末期肝病等重大疾病的治疗中展现出可喜的前景。由于缺乏充足的原代肝细胞和有效的体外分离、维持培养、体外保存及体内再殖效率、移植后免疫排斥反应而无法广泛的临床应用。因此,如何维持体外长期、高效扩增原代肝细胞,实现体内高效定植成为细胞治疗终末期肝病领域的核心问题之一。发掘可用于临床移植治疗、数量充足和体内具有再殖能力的种子细胞,并通过体内移植实现对肝衰竭救治功能的验证依赖于理想的体内模型。本课题组前期的工作中,停止给予NTBC（2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-1,3-环己二酮）后,Fah缺陷的小鼠肝脏迅速损伤坏死（受体小鼠）。然而,通过脾脏注射外源的Fah阳性肝细胞后（供体细胞）,Fah阳性细胞在2-3个月的时间内迅速替代宿主Fah阴性细胞,并且受体小鼠也获得了代谢酪氨酸的能力从而避免了肝细胞坏死和肝脏衰竭。因此,原代肝细胞移植Fah缺陷小鼠模型成功实现了肝细胞移植治疗肝衰竭。此外,在异种移植的过程中,通过对重度免疫缺陷的Fah缺陷小鼠(Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-)进行尿激酶腺病毒预处理,人肝细胞的长期再殖效率高达90%。由此可见,利用Fah缺陷小鼠的肝脏再生模型探究肝细胞命运调控机制蕴含着巨大的潜力。近年来,单细胞组学技术和细胞示踪技术的蓬勃发展,使得单细胞层面观察、示踪、分析细胞的类型和状态变得更为便捷。因此,单细胞技术及细胞示踪技术的发展为探究不同状态下肝脏再生中细胞之间复杂的相互作用提供了新的思路,有助于进一步了解肝脏的空间分布特征以及不同区域的肝细胞对肝再生的作用。本研究中,利用单细胞测序技术和细胞示踪技术,我们探究了肝细胞移植后的肝再生过程中,移植细胞状态的变化、分区特征,以及细胞再生肝脏的机制。通过对机制探究和明确,为突破肝细胞移植治疗终末期肝病的临床应用瓶颈提供可行的干预手段,进一步优化肝细胞移植治疗在终末期肝病的临床应用。第1章单细胞组学揭示肝细胞移植后发生去分化改变目的:探究宿主Fah-/-小鼠肝脏内定植的外源肝细胞变化规律方法:1.构建C57BL/6背景的Rosa26-LSL-td Tomato转基因小鼠,同时构建腺相关病毒8（AAV8-TBG-Cre）,通过尾静脉注射进行体内转染使得成熟的肝细胞携带红色荧光;2.构建C57BL/6背景的Fah基因缺陷小鼠,通过喂食7.5%的NTBC饮用水维持小鼠肝脏酪氨酸的代谢;3.将受体小鼠分为两组对照组（Sham组）和移植组,分别检测移植后3周、6周、9周、12周的小鼠肝功能相关血清学指标。通过RT-PCR、免疫荧光染色检测移植细胞td Tomato、AFP、H19、Tnfrs12a、Id3、Ki67、MCM2、PCNA、Ccnd1的表达;4.通过流式分选肝脏单细胞悬液获得移植后小鼠肝脏中的外源移植细胞及其子代细胞（标记为红色荧光）,用于制备单细胞测序样本。结果:1.空载体组和病毒转染组的血清学肝功能指标结果在不同时间点无显著性差异;H＆E染色显示肝小叶结构清晰,排列紧密;2.停止给予含有NTBC的饮用水后,Sham组的小鼠在2-3周左右迅速出现弓背、竖毛。大约在5周左右,90%的Sham组小鼠死亡。血清学检测显示小鼠ALB水平逐渐下降,伴随ALT、AST、TBIL的水平上升。与之相比,移植组小鼠状态良好,大部分的小鼠存活至9-12周。小鼠体重时间变化曲线显示,移植组小鼠在3周左右降至最低点,随后逐渐恢复至移植前水平。肝脏H＆E染色显示:移植组小鼠在移植后6周肝小叶结构恢复正常;3.单细胞测序显示:经过严格的质量控制和标准化,将捕获的28342个高质量细胞划分成13个细胞簇。基于差异表达基因,进一步将13个细胞簇分为2个群体（group1和group2）;4.通过比较两个群体肝干细胞标志物的表达情况,发现group1群体上调AFP、H19水平,同时上调肝再生相关基因Tnfrs12a和肝母细胞标志Id3的表达。通过RT-PCR和免疫荧光染色对肝脏组织中AFP、H19、Tnfrs12a、Id3进行了验证。通过与经典的三级胆道重编程进行比较,移植细胞上调表达肝细胞谱系相关基因,同时下调表达胆管谱系相关基因。结论:1.利用腺相关病毒可以高效、安全的标记小鼠肝脏成熟肝细胞。通过流式分选的方式可以实现成熟肝细胞的体外分选,并通过脾脏移植肝细胞挽救Fah基因缺陷小鼠;2.移植后3周,肝脏中外源移植细胞发生去分化,并伴随肝细胞增殖能力上调;3.移植的肝细胞在去分化过程中维持自身谱系稳定性,调控肝细胞去分化并促进肝再生。第2章肝再生过程中肝脏分区的变化及规律研究目的:探究肝再生过程中肝脏分区特征的变化规律方法:1.构建基于成熟肝细胞的Fah基因缺陷小鼠移植模型,分析移植前和移植后3周,6周,12周移植单细胞测序结果;2.基于Halpern开发的肝细胞基因分区算法,检测不同时间点移植细胞及其特定亚群的分区特征完整性和倾向性;3.利用分区特征性基因及多色荧光染色定义肝脏分区,观察野生型小鼠和Fah-/-小鼠断药（off NTBC组）后肝脏分区的变化,观察并统计td Tomato标记的移植细胞及其子代细胞在不同肝脏分区中的比例变化;4.通过鬼笔环肽对肝细胞骨架的染色,观察off NTBC组肝脏不同区域的损伤程度;5.通过AFP及分区标志的荧光共染,观察off NTBC组肝脏细胞AFP的分区特征。结果:1.经典的分区特征基因对Cyp2f2、Cyp2e1和Glul、Ass1,后续的聚类分析展现出正确的互斥型分布;2.肝再生中期6周和肝再生终末期12周的小鼠肝细胞与移植前的肝细胞类似,二者具有完整的肝脏分区和清晰的层次。然而,在肝再生早期3周的样本中,出现了一群分期特征模糊的细胞,同时上调Hamp2,、Igfbp2表达。从分空间分布上来看,3周样本过渡到6周样本时,分区特征逐渐偏离PV区。到12周时,分区特征又重新恢复到移植前的状态;3.通过分区特征基因的荧光染色结果表明,野生型小鼠肝脏分区特征完整,位于CV区附近的肝细胞呈现GS+,位于PV区附近的肝细胞呈现E-CAD+,位于二者中间的过渡区域呈现GS-E-CAD-;4.Off NTBC组1周、3周的小鼠肝脏中,E-CAD+肝细胞逐渐增加,并朝向中间区域过渡,GS+的肝细胞保持相对稳定。鬼笔环肽染色显示断药后小鼠肝脏损伤并没有分区特征。AFP与分区标志共染显示,断药后早期宿主AFP+细胞存在显著的PV分区偏倚;5.供体小鼠中,td Tomato+成熟肝细胞均匀的分布在不同区域之间。移植后宿主肝脏细胞分区特征减弱,td Tomato+肝细胞从PV区域逐渐过渡到中间区域,最后填充CV区并恢复肝脏分区特征。结论:1.肝再生过程中,移植细胞从PV区开始,沿着中间小叶区逐渐过渡到CV区并最终填充整个肝脏;2.初始的移植细胞具备显著、规律的分区特征,并在移植后早期减弱分区,同时伴随部分无分区偏倚的移植肝细胞发生去分化并表达AFP,最终恢复肝脏分区特征;3.有区域分布偏倚的宿主AFP+肝细胞主要表达在PV区,由此引发的增殖驱动力是移植细胞从PV区指向性增殖并逐渐过渡到CV的因素。第3章移植细胞再生肝脏的机制探究目的:探究移植细胞再生肝脏的机制及肝细胞可塑性的调控机制方法:1.利用非负矩阵分解（NMF）识别细胞中的表达程序,并对不同的转录程序进行通路富集;2.将NMF识别得到的转录程序P1与AFP+细胞转录组中正向相关基因取交集,利用取得交集后的基因集对group1和group2评分,并将异质性高的组别单独聚类分析,结合拟时序分析细胞亚群的发育轨迹;3.通过GSVA对不同样本进行氧化应激水平（reactive Oxidative Stress,ROS）评分,利用染色质可及性数据（ATAC-seq）联合分析关键转录因子。利用SCENIC鉴定细胞中的转录因子（transcription factors,TF）、并计算其活性,构建移植细胞潜在的基因调控网络（gene regulatory network,GRN）。结果:1.通过NMF识别所有样本的表达程序,可以得到两个稳定的转录程序P1和P2,分别对应AFP+的去分化状态细胞和功能成熟的肝细胞;2.比较移植后不同时间点的移植细胞的表达水平。移植早期肝细胞ROS水平呈现上升趋势,移植中晚期ROS水平呈现下降趋势,并恢复至移植前水平。P53的靶标基因Trp53/p53、Cdkn1a/p16、Cyp2a4/5在3周样本中显著上调。细胞内抗氧化反应的关键转录因子Nfe2l2/Nrf2及其下游驱动抗氧化基因（Hmox-1/HO-1、GST）的表达上调;3.通过比较移植后不同时间点的脂质累积情况,移植后3周的细胞中脂质累积显著上升,脂肪酸合成基因（Fasn、Acly、Elovl5）、脂肪酸转运基因（Cd36、Fabp4）和脂肪酸氧化基因（Hadh）表达上调;4.通过对移植后3周样本进行独立评分,此阶段细胞整体呈现显著的异质性。通过对AFP+细胞群体单独聚类分析,可以得到五个新的亚群C1-C5。结合拟时序分析,C3是这群AFP+细胞的起始点;5.C3群体激活转录因子Nfe2l2/Nrf2,观察到下游的靶基因由过氧化物酶体增殖物激活受体家族（peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR）调控,其中包括Cyp2a4/5、AFP;此外,C3也激活了Tbx3、Gata6、Foxa1干性相关的转录因子。TGF-β信号通路也在C3中富集,由此引发的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）成为移植后早期肝细胞去分化的关键。结论:1.移植后早期部分肝细胞发生去分化表达AFP,同时该细胞群富集P53、细胞周期、铁死亡信号通路;2.移植后早期肝细胞脂质累积增加、ROS水平显著上升,上调的P53通路参与保护肝脏功能并抑制铁死亡;其上游的Nrf2转录因子和下游的Cyp2a4/5上调以对抗氧化应激;3.由Hippo通路及其下游YAP/TAZ磷酸化状态介导的增殖表达上调成为移植后肝细胞去分化与增殖的关键