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牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌和结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性的人畜共患传染病，在世界多个国家流行，危害着人类和动物健康。目前世界卫生组织指定的检测方法是结核菌素试验方法，但该方法受物理、化学以及生物因素影响，检测周期耗时长；近年来分子生物学检测技术发展迅速，其灵敏性可靠性为结核病的检测提供了有力的支持，但是操作繁琐和易污染使其具有一定的局限性。牛分枝杆菌在感染人以后以形成传染性肉芽肿和干酪样坏死为特征，与结核分枝杆菌引起的病变类似，临床上不易进行区分。为进一步区分牛分枝杆菌、结核分枝杆菌及同为胞内寄生菌且可引起人畜结核病的鸟分枝杆菌，本研究运用荧光定量PCR技术建立了以不同特异片段为靶基因针对牛分支杆菌、结核分支杆菌和鸟分枝杆菌的检测方法。 本实验通过对Genbank公布的牛分枝杆菌TbD1序列、结核分支杆菌12.7kb插入序列以及鸟分支杆菌12-23S rDNA序列细致分析后，确定此三个片段具有菌种特异性，可通过荧光定量PCR方法进行鉴别诊断。选定目的基因，通过Primer5针对每个菌种设计1～2对引物进行筛选。每个菌种筛选出一对合适引物后，以牛分支杆菌标准株(AF2122/97)、结核分支杆菌标准株(H37Rv)、鸟分支杆菌标准株基因组为模板进行菌液PCR，将PCR产物连接pMD-18T载体。重组质粒经测序鉴定正确，菌液PCR效果良好。通过对引物浓度以及退火温度的优化，分别以经10倍梯度稀释的标准质粒pMD18-Mb、pMD18-Mtb、pMD18-Ma进行扩增，建立三种分支杆菌SYBRGreenⅠ检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行了评价，并对ELISA检测过的牛血液样本进行进一步的验证。 结果表明：成功建立了牛分支杆菌、结核分支杆菌和鸟分枝杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，M.bovis，M.tubervulosis，M.avium的反应体系中最佳引物终浓度分别为0.64μM、0.80μM、0.80μM，最佳退火温度分别为59.8℃、60.6℃、59.5℃。该方法灵敏度可达1.0×101 copies/μL，且具有良好的稳定性，批内变异系数CV值(％)均小于3％。对实验室保存的经ELISA检测的牛血液样本进行了验证，两种方法得出的结果基本相符。综上，我们建立的三种分支杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可以对M.bovis，M.tubervulosis，M.avium进行鉴别诊断及定量，为牛结核病的检测提供有力的技术支持。