目的：　　 构建一种人肿瘤坏死因子受体Ⅱ胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRⅡ-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物BHK-21S细胞的无血清培养体系中实现表达,对该融合蛋白进行了初步鉴定,并且进一步对sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的大量制备进行初步探索。　　 方法：　　 用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区基因片段,与脂联素球部基因片段融合,克隆至pAAV2neo表达载体中,构建成pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD,同时构建对照质粒pAAV2neo-Gluc-gAD。随后,用pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD；然后,将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液,细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式；最后,收获BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD无血清悬浮培养24h后的培养上清,进行sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的鉴定分析。此外,为便于后续大规模生产及对sTNFRⅡ-gAD蛋白的特性研究,采用有限稀释法筛选BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD混合细胞株,获得高表达sTNFRⅡ-gAD蛋白的单克隆细胞株,并对此细胞株进行大规模无血清转瓶培养,对培养收获的上清进行硫酸铵沉淀浓缩获得sTNFRⅡ-gAD蛋白粗制品。　　 结果：　　 (1)构建获得了pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD两种质粒,酶切与测序显示正确。　　 (2)用抗人肿瘤坏死因子受体Ⅱ和抗人脂联素球部的单克隆抗体分别检测pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性。　　 用抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-Gluc-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性,而用抗人肿瘤坏死因子受体Ⅱ检测呈现阴性。　　 (3)pAAV2neo-Gluc-gAD质粒瞬时转染BHK-21S细胞24h后上清中的Gluc有较高表达。　　 (4)免疫印迹分析用抗人肿瘤坏死因子受体Ⅱ和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测在pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的表达,并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。　　 免疫印迹分析用抗人脂联素球部的单克隆抗体检测在pAAV2neo-Gluc-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清检测到Gluc-gAD融合蛋白的表达。　　 (5)上清中sTNFRⅡ-gAD融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性,而对照Gluc-gAD蛋白不具备此活性。　　 (6)有限稀释法筛选获得相对高表达sTNFRⅡ-gAD蛋白的BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD细胞克隆株,命名为3号克隆。　　 (7)探索获得了一种快速检测上清中sTNFRⅡ-gAD蛋白表达的方法:点杂交。　　 (8)可采用硫酸铵方法对上清中sTNFRⅡ-gAD融合蛋白进行浓缩。　　 结论：　　 成功构建了pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和对照质粒pAAV2neo-Gluc-gAD,两种质粒分别转染BHK-21S细胞后相应的蛋白在上清中均获得了表达。sTNFRⅡ-gAD蛋白在上清中以单体,三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在,且此蛋白具有中和TNFα杀伤L929细胞的作用。　　 对sTNFRⅡ-gAD蛋白转瓶制备进行了初步探索,获得了高表达sTNFRⅡ-gAD蛋白的3号克隆细胞,且用硫酸铵沉淀方法对3号克隆细胞转瓶无血清培养收获的上清中的sTNFRⅡ-gAD蛋白进行了浓缩。期间探索了一种快速检测sTNFRⅡ-gAD蛋白的方法:点杂交。