论文部分内容阅读
胃癌（Gastric cancer,GC）是由多种因素引起的最常见的消化道恶性肿瘤之一,是癌症死亡的第三大原因。在中国,胃癌发病率呈显著上升趋势。早期胃癌患者一般预后较好,根治性手术疗效显著,术后5年生存率在85-90%之间。但进展期胃癌患者预后较差,中位生存期不足12个月。胃癌细胞易于侵袭和转移的生物学特性是影响患者预后的重要因素。整合素β4（Integrin β4,ITGB4）属于细胞黏附分子的整合素家族,可调控肿瘤细胞迁移、侵袭、增殖和存活等过程。肿瘤细胞可改变自身细胞表面整合素分子的表达情况促进肿瘤的发展。同时,肿瘤微环境中,非肿瘤细胞表面的整合素分子也能通过调节血管生成等过程影响肿瘤的恶性潜能。南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）,系卫矛科南蛇藤属植物。课题组前期研究证实,南蛇藤茎乙酸乙酯提取物具有抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡自噬、抑制肿瘤血管生成等生物学活性。本论文主要分析ITGB4对肿瘤进展的影响,探讨南蛇藤提取物通过靶向ITGB4抑制人胃癌AGS细胞和人胃癌MKN45细胞侵袭和迁移的作用。本研究主要分为两个部分。第一部分ITGB4的表达与胃癌的相关性分析目的:研究ITGB4的表达与胃癌等恶性肿瘤的关系,分析ITGB4对预后的影响。方法:从基因表达谱数据动态分析数据库（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）及Kaplan-Meier Plotter数据库中挖掘多个肿瘤的数据。主要比较了 404例膀胱移形细胞癌组织和28例正常组织,36例胆管癌组织和9例正常组织,486例肺鳞癌组织和338例正常组织,483例肺腺癌组织和347例正常组织,306例宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌组织和13例正常组织,275例结肠癌组织和349例正常组织,426例卵巢浆液性囊腺癌组织和88例正常组织,182例食管癌组织和286例正常组织,519例头颈部鳞状细胞癌组织和44例正常组织以及179例胰腺癌组织和171例正常组织。探究这10种恶性肿瘤组织样本与正常组织中ITGB4的表达水平。同时,分析了 GEPIA数据库中,ITGB4在408例胃癌组织和211例正常胃组织中的表达差异。ITGB4在肿瘤组织和正常组织中的表达差异采用单因素方差分析。ITGB4的表达与胃癌患者总生存期（Overall survival,OS）,无进展生存期（Progression-free survival,PFS）和后期生存期（Post progression survival,PPS）之间的关系采用Kaplan-Meier分析,生存资料主要的效应指标为风险比（HR）及相应P值和95%C1。结果:ITGB4在膀胱移形细胞癌,胆管癌,肺鳞癌,肺腺癌,宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌,结肠癌,卵巢浆液性囊腺癌,食管癌,头颈部鳞状细胞癌及胰腺腺癌肿瘤等10种不同的人恶性肿瘤组织中的表达,均高于正常组织（P＜0.05）。ITGB4的表达量在人胃癌组织中显著高于正常组（P＜0.05）。ITGB4高表达的胃癌患者总生存期、无进展生存期以及后期生存期均显著缩短（P＜0.05）。结论:ITGB4在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤中的表达显著升高,并且其表达量与胃癌患者的预后呈负相关。第二部分南蛇藤提取物通过ITGB4抑制胃癌转移的作用及机制目的:研究南蛇藤提取物通过ITGB4对人胃癌AGS和MKN45细胞的作用,并探究其分子机制。方法:MTT法检测南蛇藤提取物对人胃癌AGS和MKN45细胞的增殖活力的影响。Transwell侵袭迁移实验和划痕实验,评价南蛇藤提取物对人胃癌AGS和MKN45细胞侵袭和迁移能力的影响。高通量成像分析技术,观察细胞迁移,研究南蛇藤提取物处理后,人胃癌AGS和MKN45细胞的迁移能力变化。Western Blot实验,检测不同浓度南蛇藤提取物处理24 h后,人胃癌AGS和MKN45细胞中基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）相关蛋白及其抑制剂表达水平,上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition,EMT）相关蛋白的表达量,以及 ITGB4 及其下游蛋白PI3K、Akt、Palladin等相关蛋白的表达情况。结果:南蛇藤提取物明显抑制人胃癌AGS和MKN45细胞的增殖（P＜0.05）。Transwell实验结果显示,药物处理24 h后,人胃癌AGS和MKN45细胞的侵袭和迁移能力受到了抑制（P＜0.05）。划痕实验结果表明,药物处理组的划痕愈合能力低于对照组。由此可见,南蛇藤提取物可以显著抑制人胃癌AGS和MKN45细胞的迁移（P＜0.05）。高通量成像分析结果显示,南蛇藤提取物处理后,细胞的迁移程度低于对照组,表明药物明显抑制人胃癌AGS和MKN45细胞的迁移能力。并且,在经过不同浓度的南蛇藤提取物处理24 h后,基质金属蛋白酶相关蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表达水平下降,而TIMP-1蛋白表达水平升高（P＜0.05）。南蛇藤提取物抑制EMT进程,上皮-间质转化相关蛋白N-cadherin和Vimentin表达水平下降,E-cadherin表达水平升高（P＜0.05）。经过南蛇藤提取物处理后,ITGB4、Akt、PI3K和Palladin蛋白的表达水平下降,表明南蛇藤提取物通过作用于ITGB4及其下游蛋白,抑制了人胃癌AGS和MKN45细胞的侵袭和迁移。结论:南蛇藤提取物通过调控ITGB4/PI3K/Akt/Palladin信号通路,显著抑制人胃癌AGS和MKN45细胞的增殖以及侵袭迁移能力。本研究为南蛇藤提取物抗肿瘤的发展,提供了新的理论基础和科学依据。