四川省甘孜藏族自治州藏猪A群轮状病毒的分子检测和基因组研究

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猪A群轮状病毒(Porcine rotavirus group A,PoRVA)是引起仔猪腹泻的重要病原,对养猪业造成了重大的经济损失。并且,PoRVA还可跨种间传播到人和牛等多种哺乳动物,具有重要的公共卫生学意义。该病毒已经在国内猪中广泛流行,但关于藏猪源RVA的流行病学资料很少。本研究的目的是对2021年度四川省甘孜藏族自治州(以下简称甘孜州)7个地区的藏猪养殖场进行PoRVA的分子检测,并对成功分型的样本进行分离鉴定及基因组分析研究,取得如下成果:1.2021年甘孜州藏猪A群轮状病毒的检测和基因分型2021年5~6月采集了甘孜州乡城县、巴塘县、泸定县、得荣县、稻城县、雅江县、理塘县,共7个藏猪场的腹泻粪便样本74份,非腹泻粪便样本202份。采用特异性检测PoRVA的RT-PCR方法对样本进行检测,阳性样本进一步调查PoRVA和猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)的混合感染情况。结果显示,腹泻样本中PoRVA阳性率为24.3%,非腹泻样本中PoRVA阳性率为0.99%;藏猪场阳性检出率为57.1%;PEDV、TGEV和PDCo V均未检出。本实验从PoRVA阳性样本中共鉴定出2种G型,1种P型,其中G型为G9型(2/9)和G10(7/9)型;P型为P[13]型(4/4);G型和P型均能定型的毒株有4个,2个为G9P[13]型,2个为G10P[13]型。本实验结果表明,PoRVA是导致藏猪仔猪腹泻的重要病原,至少存在G9P[13]和G10P[13]两个基因型,为甘孜州藏猪仔猪腹泻的防控提供了参考。2.藏猪源G9P[13]型PoRVA的分离鉴定和基因组研究采用MA-104细胞对2个为G9P[13]型和2个为G10P[13]型PoRVA进行分离鉴定,成功分离到1株致细胞病变的G9P[13]型毒株,G10P[13]型未能分离成功。G9P[13]型阳性病料接种细胞后盲传至第3代,细胞于72h后出现细胞脱落、圆缩、拉丝并且脱落细胞聚拢的病变,连续传代至第5代时,细胞在36h出现稳定病变,经RT-PCR检测、间接免疫荧光及电镜观察鉴定为G9P[13]型PoRVA。命名为RVA/Piglet-tc/CHN/SCLT-FX17/2021/G9P[13],以下简称为SCLT-FX17株。该毒株经蚀斑纯化后的TCID50为10-5.38/100μL。经RT-PCR方法对样本进行基因扩增,成功获得了SCLT-FX17分离株基因组的11个完整节段序列,经Rota C2.0基因分析软件对该毒株基因组进行分型,基因型为G9-P[13]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T7-E1-H1。序列比对和系统发育树表明,SCLT-FX17株的VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP4、NSP5基因起源于PoRVA,NSP1、NSP2和NSP3基因可能源于人A群轮状病毒,为人源毒株与猪源毒株重配毒株。与Gen Bank中登录的全部33条中国G9型猪源毒株比较,SCLT-FX17株VP7基因有3处独特的核苷酸无义变异(A270G、T459C、A861G);与Gen Bank中登录的全部12条中国P[13]型猪源毒株比较,SCLT-FX17株VP4基因共有18处核苷酸变异,导致7处氨基酸变异,分别位于VP8区域(T120N)和VP5区域(S534A、M551R、K553R、K555T、N558D、L774T),但未发生在中和表位区域,这些氨基酸突变的生物学意义有待于进一步的研究。本实验成功分离到1株藏猪源G9P[13]型PoRVA并获得了全基因组序列,为深入了解其分子特征和遗传进化提供了重要参考。遗传进化分析显示,该毒株基因组呈现出人源毒株和猪源毒株重配的现象,提示可能存在跨种间传播的能力,其公共卫生学意义值得进一步关注。
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