研 究 目 的 : 通 过 细 胞 工 程 的 方 法 制 备 重 组 幽 门 螺 杆 菌(Helicobacter pylori,H.pylori)细胞空泡毒素抗原(vacuolating cytotoxin antigen,VacA)的单克隆抗体(简称单抗),并初步研究其应用。为制备检测 VacA 的试剂盒及探讨 VacA 的致病机制奠定基础。 方法:本实验分两部分进行 一 、重组 VacA 的表达与纯化:在已构建的基因工程(pQE30-V-DH5α)基础上,大量诱导表达获得重组蛋白 VacA。用 SDS-PAGE 分析表达形式,Western blot 鉴定其抗原性, Ni2+-NTA 树脂纯化表达蛋白,SDS-PAGE 鉴定其纯度,Bradford 法测定蛋白浓度。用重组蛋白建立检测小鼠 VacA 抗体的间接 ELISA,评价重组蛋白免疫原性。 二、 VacA 单克隆抗体的制备和初步应用:1.以纯化所得 VacA 为抗原免疫 BALB/c 小鼠,40 天后间接 ELISA 测小鼠尾静脉血以检测有无抗体产生;2.将脾细胞与骨髓瘤细胞用 50%聚乙二醇(PEG)融合,HAT 培养基培养选择出融合细胞,用建立的间接 ELISA 法筛选分泌VacA 抗体的细胞;3. 有限稀释法克隆化培养,间接 ELISA 法检测能稳定分泌抗 VacA 抗体的阳性细胞株,b.v 公司的抗体亚型检测试剂盒测定抗体类别;4.用间接 ELISA 法测定体外传代培养的 zhD4 细胞株分泌抗体的稳定性;5. 大量制备 zhD4 细胞株小鼠腹水后,饱和硫酸铵沉淀法初步纯化,间接 ELISA 法测定其效价,Bradford 法测定蛋白含量;6.用制备的单克隆抗体建立初步应用于胃粘膜中 VacA 的检测。