土贝母苷甲是从传统中药土贝母中分离纯化得到的一种三萜皂苷化合物。药用土贝母为葫芦科土贝母属植物土贝母[Bolbostemma paniculatum (Maxim.) Franquet]的块茎。土贝母原载于清代赵氏编纂的《本草纲目拾遗》,在《中药大辞典》和《中华人民共和国药典》中都有土贝母的相关记载。其性味苦、微寒,归肺、脾经,有清热解毒、消肿散结等功效。土贝母中含有皂苷类、甾醇及其苷类和酯类、生物碱类等多种化学成分。其中皂苷类含量较大,为土贝母的主要活性成分。土贝母苷甲是从土贝母中分离纯化,且得率最高的抗癌活性成分。近年来,有关土贝母苷甲的研究表明,土贝母苷甲具有抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。本课题采用生物化学和分子生物学等技术方法,研究了土贝母苷甲诱导细胞发生凋亡的分子途径和细胞生物学机制,研究了土贝母苷甲与微管蛋白的相互作用,以期进一步阐明土贝母苷甲抗肿瘤作用的分子机理,并试图研究土贝母苷甲在细胞内的作用靶点,为将其开发成新的抗癌药物奠定基础。1.土贝母苷甲抗肿瘤作用的凋亡机制研究采用MTT法测定了土贝母苷甲对7种不同来源的癌细胞(人肺癌细胞系A-549、人肝癌细胞系Bel-7402、人食道癌细胞系Eca-109、人宫颈癌细胞系Hela,人肝癌细胞系HepG2、人前列腺癌细胞系PC-3、人胃癌细胞系SGC-7901)的细胞毒性。实验结果表明,土贝母苷甲能有效的地抑制这7种肿瘤细胞的生长,具有良好的抗肿瘤作用。其中人肝癌细胞系HepG2对土贝母苷甲的作用最为敏感,于是后续的实验选用HepG2细胞作为研究对象。针对凋亡发生的特征性质,采用了如下的检测手段,测定了土贝母苷甲对HepG2细胞的凋亡作用。通过荧光染色法观察了土贝母苷甲对HepG2细胞核形态的影响。数据分析表明,土贝母苷甲的作用能使HepG2细胞的细胞核皱缩、聚集,并破碎成凋亡小体。采用琼脂糖凝胶电泳分析了经土贝母苷甲处理后的HepG2细胞的DNA,结果发现,土贝母苷甲能促使HepG2细胞的DNA呈凋亡特征性的片段。这些形态学的变化,可以初步断定土贝母苷甲对HepG2细胞的凋亡作用。为了进一步确定土贝母苷甲能引起HepG2细胞发生凋亡,接下来使用免疫印迹实验测定了土贝母苷甲对HepG2细胞内凋亡执行分子caspases表达的影响。Caspases家族蛋白是凋亡发生的执行蛋白,在体内处于酶原形式。当凋亡发生的时候,caspases家族的蛋白被水解成活化形式,从而产生执行凋亡的作用。凋亡的分子途径分为两种,一种是外源途径,一种是内源途径。不同的caspases蛋白在不同的途径中起到不同的作用。实验中检测的是caspase-8,-9,-3三种蛋白。其中caspase-8通过外源途径的上游分子激活,caspase-9通过内源途径的上游分子激活,它们的活化最终导致caspase-3的激活。实验结果证明,经过土贝母苷甲的作用后的HepG2细胞内的caspase-8,-9,-3均发生了酶原形式到活化形式的转变。这样,可以基本确定土贝母苷甲对HepG2细胞的凋亡作用。同时,对外源途径和内源途径上游分子也同样进行了免疫印迹实验。调控外源途径的Fas蛋白及其配体FasL(Fas Ligand)在土贝母苷甲的作用下,随着时间和浓度的增加,在细胞内的表达量也明显增加。这说明了,凋亡过程中外源途径被激活。调控内源途径的Bcl-2家族的蛋白也在土贝母苷甲的作用下,表达量发生了改变。其中抗凋亡的Bcl-2蛋白明显降低,而促凋亡的Bak蛋白明显升高。这说明了,凋亡过程中内源途径也同样参与了作用。这些实验结果表明,土贝母苷甲能诱导HepG2细胞产生凋亡,并且该过程由外源途径和内源途径的共同参与调控完成的。采用流式细胞术检测了土贝母苷甲对HepG2活性氧水平的调控和细胞周期的影响。结果显示,土贝母苷甲的作用能促使HepG2细胞内活性氧水平的明显增高。在低浓度和短时间作用下,土贝母苷甲能明显促使HepG2细胞周期阻滞在G2/M期。随着作用浓度和时间的延长,细胞的亚二倍体峰明显增高。在细胞凋亡发生之前,土贝母苷甲能引起HepG2细胞的G2/M期周期阻滞。通过免疫印迹法检测了该过程的几个调控因子。土贝母苷甲能抑制TNF-a和NF-κB在HepG2细胞中的表达,能促进JNK分子的磷酸化,而p53蛋白的表达也在该过程中受到影响。说明土贝母苷甲引起细胞G2/M周期阻滞和活性氧水平增高,从而引起凋亡过程的发生,在这个过程当中NF-κB和JNK的信号通路起到了重要作用,而且p53也参与了该过程的调控。2.土贝母苷甲与微管蛋白的相互作用为了寻找土贝母苷甲在体内的作用靶点,证实土贝母苷甲与微管蛋白的相互作用,首先研究了土贝母苷甲对HepG2细胞中微管蛋白表达的影响。结果发现,土贝母苷甲处理后的细胞内,微管蛋白的表达量增高。之后从猪脑中采用二次聚合-解聚的分离纯化方法得到了纯度高、含量大的微管蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测提取得到的蛋白纯度高于95%,使用BCA蛋白定量试剂盒检测其浓度是6359.12ug/ml。通过免疫印迹法,用微管蛋白抗体检测得到的结果呈阳性,确定提取得到的蛋白就是微管蛋白。采用荧光光谱法和分子模拟技术,对土贝母苷甲和微管蛋白的相互作用进行了研究。荧光光谱分析结果表明,土贝母苷甲能引起微管蛋白内源荧光的淬灭,说明了土贝母苷甲在体外与微管蛋白能发生相互作用。分子模拟结果表明,土贝母苷甲结合在微管蛋白两个亚基之间,其结合位点不同于秋水仙碱与微管蛋白的结合位点,也不同于紫杉醇与微管蛋白的结合位点。土贝母苷甲与微管蛋白的结合能形成两个氢键。